Desarrollo y optimización de métodos para el contaje de colonias en ensayos clonogénicos

Abstract

[ES] El uso de las terapias contra el cáncer basadas en hadrones es un creciente campo de I+D, que ha demostrado en algunos casos, importantes ventajas físicas, radiológicas y clínicas en comparación con las técnicas convencionales de radioterapia con rayos-X. Desde hace un tiempo se estudia su uso combinado con nanopartículas. Se pretende evaluar si estas pueden tener un efecto potenciador en la eficacia de la radioterapia. Para caracterizar el efecto de las nanopartículas en combinación con la radiación, los ensayos más utilizados son los clonogénicos. Estos ensayos son una de las técnicas fundamentales en la investigación de nuevos tratamientos, ya que evalúan la capacidad de proliferación de las células al formar colonias. Sin embargo, los resultados parecen ser controvertidos y dependientes de los métodos que se utilicen para cuantificar las colonias.

En este trabajo se utilizaron imágenes de placas de pocillos en distintas condiciones, incluyendo la presencia de nanopartículas de oro y dosis variables de radiación. El propósito principal de este proyecto ha sido mejorar la detección automática de colonias, incrementando su exactitud y eficacia. Para ello, se utilizaron técnicas avanzadas de preprocesamiento y análisis de imágenes, como operaciones morfológicas y la técnica de watershed. Esta última ha sido fundamental para la segmentación, permitiendo separar algunas de las colonias solapadas que son difíciles de contabilizar. Además, se ha desarrollado una interfaz intuitiva que posibilita modificar parámetros, ver los resultados de diversas formas y corregir los recuentos de colonias, lo que simplifica la obtención de resultados más precisos.

A lo largo del proyecto, se optimizaron los parámetros del algoritmo para obtener los mejores resultados posibles. Los resultados mostraron que, aunque cuantificar la eficacia del algoritmo es complejo debido a la subjetividad inherente en el análisis manual de colonias, los resultados obtenidos fueron comparables a los de ImageJ, el estándar de oro para la contabilización de colonias, alcanzando una exactitud de segmentación del 92%. No obstante, se identificaron varias limitaciones, como las dificultades para separar colonias muy solapadas y la variabilidad biológica que añade incertidumbre, observándose anomalías en algunas muestras.

Este trabajo ha aportado un nuevo algoritmo implementado en una herramienta útil y práctica para el contaje y segmentación de colonias celulares en ensayos clonogénicos, mejorando la automatización del proceso y proporcionando una base sólida para futuras mejoras en este campo.

[EN] The use of hadron-based cancer therapies is a growing field of R&D, which has demonstrated, in some cases, important physical, radiological and clinical advantages compared to conventional X-ray radiotherapy techniques. Its use in combination with nanoparticles has been studied for some time. The aim is to evaluate whether these can have an enhancing effect on the effectiveness of radiotherapy. To characterize the effect of nanoparticles in combination with radiation, the most used assays are clonogenic. These assays are one of the fundamental techniques in the research of new treatments, since they evaluate the proliferation capacity of cells when forming colonies. However, the results appear to be controversial and dependent on the methods used to quantify the colonies.

In this work, images of well plates under different conditions were used, including the presence of gold nanoparticles and variable doses of radiation. The main purpose of this project has been to improve automatic colony detection, increasing its accuracy and efficiency. To do this, advanced image preprocessing and analysis techniques were used, such as morphological operations and the watershed technique. The latter has been fundamental for segmentation, allowing us to separate some of the overlapping colonies that are difficult to count. Additionally, an intuitive interface has been developed that makes it possible to modify parameters, view results in various ways, and correct colony counts, making it easier to obtain more accurate results.

Throughout the project, the algorithm parameters were optimized to obtain the best possible results. The results showed that, although quantifying the effectiveness of the algorithm is complex due to the subjectivity inherent in manual colony analysis, the results obtained were comparable to those of ImageJ, the gold standard for colony counting, achieving a segmentation accuracy of 92%. However, several limitations were identified, such as difficulties in separating highly overlapping colonies and biological variability that adds uncertainty, with anomalies observed in some samples.

This work has provided a new algorithm implemented in a useful and practical tool for counting and segmenting cell colonies in clonogenic assays, improving the automation of the process and providing a solid basis for future improvements in this field.

[CA] L'ús de les teràpies contra el càncer basades en hadrons és un creixent camp de R+D, que ha demostrat en alguns casos importants avantatges físics, radiològics i clínics en comparació amb les tècniques convencionals de radioteràpia amb raigs-X. Des de fa un temps se n'estudia l'ús combinat amb nanopartícules. Es pretén avaluar si poden tenir un efecte potenciador en l'e càcia de la radioteràpia. Per caracteritzar l'efecte de les nanopartícules en combinació amb la radiació, els assaigs més utilitzats són els clonogènics. Aquests assaigs són una de les tècniques fonamentals en la investigació de nous tractaments, ja que avaluen la capacitat de proliferació de les cèl·lules en formar colònies. Tot i això, els resultats semblen ser controvertits i dependents dels mètodes que s'utilitzen per quanti car les colònies. En aquest treball es van utilitzar imatges de plaques de pouets en diferents condicions, incloent-hi la presència de nanopartícules d'or i dosis variables de radiació. El propòsit principal d'aquest projecte ha estat millorar la detecció automàtica de colònies, incrementant-ne l'exactitud i l'e càcia. Per fer-ho, es van utilitzar tècniques avançades de preprocessament i anàlisi d'imatges, com ara operacions morfològiques i la tècnica de watershed. Aquesta última ha estat fonamental per a la segmentació, permetent separar algunes de les colònies solapades que són difícils de comptabilitzar. A més, s'ha desenvolupat una interfície intuïtiva que possibilita modi car paràmetres, veure els resultats de diverses maneres i corregir els recomptes de colònies, cosa que simpli ca l'obtenció de resultats més precisos. Al llarg del projecte, es van optimitzar els paràmetres de l'algorisme per obtenir els millors resultats possibles. S'ha mostrat que, tot i quanti car l'e càcia de l'algorisme és complex a causa de la subjectivitat inherent a l'anàlisi manual de colònies, els resultats obtinguts van ser comparables als d'ImageJ, l'estàndard d'or per a la comptabilització de colònies, aconseguint una exactitud de segmentació del 92%. Tot i això, es van identi car diverses limitacions, com les di cultats per separar colònies molt solapades i la variabilitat biològica que afegeix incertesa, observant-se anomalies en algunes mostres. Aquest treball ha aportat un nou algorisme implementat en una eina útil i pràctica per al comptatge i la segmentació de colònies cel·lulars en assaigs clonogènics, millorant l'automatització del procés i proporcionant una base sòlida per a futures millores en aquest camp.