Las co-chaperonas CHIP y HOP como nuevos sustratos del complejo Laforina/Malina

Abstract

[ES] La enfermedad de Lafora (LD) es un tipo de epilepsia mioclónica progresiva de herencia autosómica recesiva que está causada por mutaciones en los genes EPM2A y EPM2B (NHLRC1), los cuales codifican Laforina y Malina, respectivamente. Actualmente no existe cura para esta afección, cuyos síntomas empiezan a manifestarse durante la adolescencia temprana, progresando de manera rápida con un patrón neurodegenerativo acompañado de crisis tónico-clónicas y un cuadro clínico de deterioro cognitivo y demencia, falleciendo los pacientes en un plazo aproximado de 10 años. Los genes mutados en la enfermedad codifican una glucógeno fosfatasa (Laforina) y una ubiquitin ligasa de tipo E3 (Malina). Ambas proteínas forman un complejo funcional. Alteraciones de éstas causan una desregulación en el metabolismo del glucógeno, caracterizado por la formación de agregados insolubles de poliglucosanos. Estos acúmulos se han observado en el citoplasma de células del sistema nervioso, corazón, músculo esquelético e hígado. Por el momento, no se conoce por completo el mecanismo fisiopatológico de la enfermedad, pero se han observado alteraciones en diferentes procesos celulares como la ruta de la autofagia, la degradación de proteínas por medio del proteasoma, el estrés oxidativo, la función mitocondrial y la presencia de una neuroinflamación crónica, entre otros. En un estudio de escrutinio de alto rendimiento, basado en la comparación in silico de los ubiquitomas de células que sobreexpresaban Malina silvestre con células que sobreexpresaban la forma mutada más común en LD, Malina P69A, se pudieron identificar 88 candidatos a ser sustrato del complejo Laforina-Malina (Kumarasinghe et al.,2023). De estos 88 posibles sustratos, se han validado recientemente Hsp90 y HspA1L, dos chaperonas de respuesta a estrés térmico que están relacionadas entre sí y que resultan fundamentales para el mantenimiento de la proteostasis. Otro de los candidatos identificados fue STIP1, también conocido como HOP (Hsp70-Hsp90 Organizing Protein), que ejerce un papel regulador de la maquinaria de chaperonas Hsp90-Hsp70, interaccionando con ambas. Así mismo, se ha descrito CHIP (C terminal Hsp70 binding protein), como una co-chaperona estrechamente relacionada con la degradación de proteínas cliente del sistema Hsp90-Hsp70, que tiene actividad E3 ubiquitin ligasa. Este trabajo tiene como objetivo principal definir CHIP y HOP como nuevos sustratos del complejo Laforina-Malina. También se propone estudiar la manera en la que estas proteínas interaccionan con el complejo bajo distintas condiciones, así como analizar el papel de dicha modulación en la fisiología celular. Durante este trabajo se analizaron los resultados de múltiples ensayos de ubiquitinación e interacción proteína-proteína, demostrando que las co-chaperonas HOP y CHIP son sustratos del complejo Laforina-Malina, y planteando naturaleza de la interacción física entre el complejo enzimático y el sustrato, pudiendo concluir que HOP interacciona con el complejo en presencia de ambos componentes mientras que CHIP interacciona exclusivamente con Malina. Con esto se abre la oportunidad de estudio de una nueva ruta afectada en la enfermedad de Lafora, planteándose una nueva dirección para la investigación sobre los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a esta epilepsia mioclónica progresiva.

[EN] Lafora disease (LD) is a type of progressive myoclonic epilepsy inherited in an autosomal recessive manner, caused by mutations in the EPM2A and/or EPM2B (NHLRC1) genes, which encode Laforin and Malin, respectively. Currently, there is no cure for this condition, whose symptoms begin to manifest during early adolescence and rapidly progress with a neurodegenerative pattern, accompanied by tonic-clonic seizures and clinical signs of cognitive decline and dementia. Patients typically die within approximately 10 years. The mutated genes in the disease encode a glycogen phosphatase (Laforin) and an E3-type ubiquitin ligase (Malin). Both proteins form a functional complex. Alterations in these proteins lead to dysregulation of glycogen metabolism, characterized by the formation of insoluble polyglucosan aggregates. These accumulations have been observed in the cytoplasm of cells in the nervous system, heart, skeletal muscle, and liver. Although the exact pathophysiological mechanism of the disease is not yet fully understood, various cellular processes are affected, including the autophagy pathway, proteasomal degradation, oxidative stress, mitochondrial function, and chronic neuroinflammation, among others. In a high-throughput screening study based on in silico comparison of the ubiquitomes of cells overexpressing wild-type Malin with those overexpressing the most common mutated form in LD, Malin P69A, 88 candidates were identified as potential substrates of the Laforin-Malin complex (Kumarasinghe et al., 2023). Of these 88 potential substrates, two heat stress response chaperones, Hsp90 and HspA1L, which are closely related and crucial for maintaining proteostasis, have recently been validated. Another identified candidate was STIP1, also known as HOP (Hsp70-Hsp90 Organizing Protein), which plays a regulatory role in the Hsp90-Hsp70 chaperone machinery by interacting with both. Additionally, CHIP (C-terminal Hsp70 Interacting Protein) has been described as a co-chaperone closely linked to the degradation of client proteins by the Hsp90-Hsp70 system, and it also possesses E3 ubiquitin ligase activity. The primary objective of this work is to define CHIP and HOP as new substrates of the Laforin-Malin complex. It also aims to study how these proteins interact with the complex under different conditions and analyse this modulation's role in cellular physiology. Throughout this work, the results of multiple ubiquitination and protein-protein interaction assays were analyzed, demonstrating that the co-chaperones HOP and CHIP are substrates of the Laforin-Malin complex, and suggesting the nature of the physical interaction between the enzymatic complex and the substrate. It can be concluded that HOP interacts with the complex in the presence of both components, while CHIP interacts exclusively with Malin. This opens the opportunity to study a new pathway affected in Lafora disease, proposing a new direction for research on the pathophysiological mechanisms underlying this progressive myoclonic epilepsy.