Estudio de la clonalidad de aislados clínicos del complejo Mycobacterium tuberculosis del área de influencia del Hospital General y Hospital Clínico Universitario de Valencia mediante análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción amplificados (AFLP)

Abstract

[ES] Introducción/Objetivo: Este estudio pretende analizar la utilidad de la técnica AFLP simplificada como herramienta molecular para estudiar la clonalidad de aislados clínicos de Mycobacterium tuberculosis complex. Material y métodos: Se seleccionaron 63 aislados clínicos pertenecientes a las colecciones de los Servicios de Microbiología de dos Hospitales Universitarios de Valencia, identificados por métodos convencionales y moleculares como M. tuberculosis complex (Accuprobe¿ Gen-Probe, bioMérieux; Genotype¿, Hain Life Science): M. africanum 1 (6), M. bovis ssp. BCG (2) y M. tuberculosis (55). Los stocks fueron descongelados y sembrados en medio de Löwenstein-Jensen e incubados en estufa de atmósfera convencional a 37°C. Cuando el crecimiento fue óptimo se realizó la técnica de AFLP, según el protocolo de Viader-Salvadó et al. (2009) modificado: i) lisis celular (lisozima-proteinasa K-CTAB-NaCl); ii) extracción de DNA genómico (clorofomo-alcohol isoamílico); iii) digestión con la endonucleasa de restricción XhoI; iv) ligación con un adaptador de doble cadena compuesto por las secuencias XA-1 (GTAGACTGCGTACATGCA) y XA-2 (TCGATGCATGTACGCAGT); v) amplificación del DNA digerido y ligado con el iniciador XP-G primer (TGCGTACATGCATCGAGG). Los amplicones se separaron mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa (2%, p/v) y se calculó el tamaño relativo de los fragmentos mediante el programa informático Bio-1D++, que además permite establecer la similitud entre los aislados y la obtención de los dendrogramas de homología. Este ensayo fue repetido en dos ocasiones con 10 aislados seleccionados al azar. Los electroferogramas fueron agrupados en clusters según los criterios de Gaafar et al. (2003). El poder discriminatorio del método se cálculo según el índice de diversidad de Simpson (Dillon et al. 1993). Resultados: Se obtuvieron de 7 a 12 bandas con tamaños relativos comprendidos entre 750 y 200 pb, que permitieron la definición de siete clusters (P1, 35; P2, 17; P3, 3; P4, 3; P5, 3; P6, 1; P7,1) cuya similitud variaba entre 96% (P1 vs. P2) y 74% (P2 vs. P6). Los aislados identificados como M. africanum 1 se incluyeron en P1, M. bovis ssp. BCG en P5 y M. tuberculosis se distribuyó en todos los patrones. Los ensayos de repetición permitieron constatar que los aislados seleccionados mostraban el mismo patrón de bandas. El poder discriminatorio del método fue del 0,6211. Conclusiones: Los resultados obtenidos demuestran que AFLP simplificada es una herramienta molecular adecuada para la realización de estudios epidemiológicos iniciales de Mycobacterium tuberculosis complex ya que es un método reproducible y de sencilla realización, que permite la agrupación de los aislados en diferentes clusters. Aunque, su moderado poder discriminatorio podría mejorarse con el estudio de un número mayor de aislados y el ensayo de nuevos iniciadores.

[EN] Introduction / Objective: This study analyzes the usefulness of the simplified AFLP technique as a tool to study molecular clonality of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis complex. Material and methods: We selected 63 clinical isolates from the collections of the microbiology services of two university hospitals in Valencia, identified by conventional and molecular methods as M. tuberculosis complex (Gen-Probe AccuProbe ¿, bioMérieux; Genotype ¿, Hain Life Science): M. africanum 1 (6), M. bovis ssp. BCG (2) and M. tuberculosis (55). Stocks were thawed and grown in Lowenstein-Jensen medium and incubated in conventional air oven at 37 ° C. When optimal growth was performed AFLP technique, according to the protocol Viader-Salvado et al. (2009) modified: i) cell lysis (lysozyme-proteinase K-CTAB-NaCl), ii) genomic DNA extraction (chloroform-isoamyl alcohol), iii) digestion with the restriction endonuclease XhoI iv) an adapter ligation with Double-stranded sequences comprising XA-1 (GTAGACTGCGTACATGCA) and XA-2 (TCGATGCATGTACGCAGT); v) amplification of DNA digested and ligated with the initiator XP-G primer (TGCGTACATGCATCGAGG). The amplicons were separated by horizontal electrophoresis in agarose gels (2% w / v) was calculated and the relative size of the fragments by software Bio-1D + +, which also allows for the similarity between isolates and obtaining the dendrograms homology. This test was repeated twice with 10 randomly selected isolates. The electropherograms were grouped into clusters according to the criteria of Gaafar et al. (2003). The discriminatory power of the method was calculated according to Simpson's diversity index (Dillon et al. 1993). Results: were obtained from 7 to 12 bands with relative sizes between 750 and 200 bp, which allowed the definition of seven clusters (P1, 35, P2 17, P3, 3, P4, 3, P5, 3, P6, 1 ; P7, 1) whose similarity ranged from 96% (vs. P1. P2) and 74% (vs P2. P6). The isolates identified as M. africanum 1 is included in P1, M. bovis ssp. P5 BCG and M. tuberculosis was distributed in all patterns. Repeat testing led to evidence that the selected isolates showed the same pattern of bands. The discriminatory power of the method was 0.6211. Conclusions: The results obtained show that simplified AFLP is a suitable molecular tool for epidemiological studies of Mycobacterium tuberculosis complex early because it is a reproducible and simple implementation, which allows the grouping of isolates into different clusters. Although the moderate discriminatory power could be improved by studying a larger number of isolates and testing of new primers.