Identificación del interactoma de proximidad de la proteína CEREBLON de Arabidopsis thaliana mediante marcaje de proximidad con TurboID

Abstract

[ES] El estrés abiótico supone un grave impacto en el crecimiento, productividad y calidad nutricional de los cultivos. Un abordaje innovador para identificar proteínas relacionadas con la respuesta a estrés y descubrir sus mecanismos subyacentes es el marcaje de proximidad basado en biotina. Un gran avance en el campo del marcaje de proximidad ha sido TurboID, una biotina ligasa desarrollada a través de la evolución dirigida. TurboID presenta diferentes ventajas respecto a los enzimas empleados tradicionalmente en el marcaje de proximidad, como su naturaleza no tóxica, su elevada eficiencia catalítica o su rápida dinámica de marcaje. Esta técnica ha demostrado especial eficacia en la detección de proteínas que interaccionan débil o transitoriamente con la proteína de interés, así como en la identificación in vivo de proteomas locales restringidos espacial o temporalmente. CRBN es una proteína con actividad E3-ligasa muy importante en humanos, puesto que algunas mutaciones en esta proteína se relacionan con enfermedades graves como el retraso mental. A pesar de que se ha estudiado ampliamente en humanos, debido a su importancia como diana de fármacos basados en la tecnología PROTAC, no ha sido estudiada en plantas. En el laboratorio hemos identificado AtCRBN como el ortólogo funcional de HsCRBN en plantas. En este proyecto hemos aplicado la biología molecular para clonar diferentes fusiones de TurboID_AtCRBN, que nos han permitido realizar experimentos de expresión transitoria acoplada a microscopía confocal, empleando Nicotiana benthamiana como planta modelo. Tras la expresión transitoria de las proteínas de fusión GFP-TurboID, GFP-TurboID_AtCRBN y GFP-TurboID_linker_AtCRBN, analizamos su localización subcelular, que resultó ser núcleo-citoplasmática. A continuación, optimizamos el proceso de marcaje de proximidad basado en biotina, también mediante la expresión transitoria de las proteínas de fusión en hojas de N. benthamiana. Llevamos a cabo el proceso de marcaje de proximidad e identificamos mediante proteómica cuantitativa 10 proteínas candidatas a interaccionar con AtCRBN in vivo. Dos de ellas, SGT1 y Hsp70, destacaron por su implicación previamente descrita en la formación de complejos E3-ligasa SCF y en el sistema de degradación proteica del Ubiquitina-Proteasoma. Paralelamente, también generamos plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan las proteínas de fusión GFP-TurboID, GFP-TurboID_AtCRBN y GFP-TurboID_linker_AtCRBN. Estas nuevas proteínas identificadas nos sugieren que AtCRBN forma parte de complejos E3-ligasa de tipo SCF en plantas y no de complejos CRL4 como está descrito en el caso de humanos. Estos datos nos ayudarán a desarrollar nuevos abordajes, empleando los complejos E3-ligasa como diana de pequeñas moléculas. Estas moléculas son los PROTACs, que destacan por su importancia en las nuevas terapias de degradación selectiva de proteínas diana en biomedicina. Mediante la selección de las dianas apropiadas a degradar, podríamos desarrollar PROTACs capaces de aumentar la resiliencia de las plantas frente al cambio climático, contribuyendo a alcanzar el Objetivo de Desarrollo Sostenible Acción por el Clima .

[EN] Abiotic stresses severely impact growth, productivity, and nutritional quality of crops. One innovative approach to identify stress-responsive proteins and unravelling their underlying molecular mechanisms is Biotin-based Proximity Labeling. A groundbreaking development in the field of Proximity Labeling is TurboID, a biotin ligase that has emerged through directed evolution. TurboID offers several distinct advantages over traditional protein-labeling enzymes, such as its non-toxic nature, time-saving capabilities, and remarkable catalytic efficiency. This technique has proven particularly effective in detecting transient or weak protein interactions, as well as revealing spatially or temporally restricted local proteomes within living cells. CRBN is an E3-ligase very important in humans, as mutations on this protein are related to serious diseases such as mental retardation. Although it has been deeply studied in humans, due to its importance as target of PROTAC-based drugs, it has not been fully explored in plants. In the laboratory we have identified AtCRBN as the functional counterpart of HsCRBN in plants. In this project we have applied molecular biology to clone different TurboID_AtCRBN fusions, enabling transient expression experiments coupled with confocal microscopy, using Nicotiana benthamiana as a model plant. After transient expression of GFP-TurboID, GFP-TurboID_AtCRBN and GFP-TurboID_linker_AtCRBN fusion proteins, we analysed their subcellular localization, which was found to be nucleocytoplasmic. In the next step, we optimized the Biotin-based proximity labeling process, also with transient expression of fusion proteins in N. benthamiana leaves. We performed the proximity labeling assay and identified by quantitative proteomics 10 candidate proteins of being interacting in vivo with AtCRBN. Two of them, SGT1 and Hsp70, stood out because of their previously reported roles in E3 ligase complexes and in the Ubiquitin-Proteasome System. At the same time, we also generated transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing GFP-TurboID, GFP-TurboID_AtCRBN and GFP-TurboID_linker_AtCRBN fusions. This newly identified proteins suggest that AtCRBN is part of SCF E3-ligase complexes in plants and not part of CRL4 complexes as described in humans. These findings will help us to develop novel approaches, using E3-ligase complex as the target of small molecules. These molecules are PROTACs, which stand out due to their contribution in the new therapies based on targeted protein degradation in biomedicine. Choosing the appropriate degradation targets, we could develop PROTACs that increase plant resilience to climate change, directly contributing to achieve the Sustainable Development Goal number 13, Climate Action .