Mode of Action and Rational Design of Antifungal Proteins from Penicillium Expansum

[ES] Los hongos patógenos son un riesgo para la salud y la seguridad alimentaria, debido a las infecciones fúngicas y las cepas multirresistentes. Las proteínas antifúngicas (AFPs) son proteínas catiónicas, ricas en cisteína y secretadas por hongos filamentosos que emergen como una alternativa para el desarrollo de nuevos antifúngicos, debido a sus propiedades fisicoquímicas, actividad de amplio espectro y no toxicidad. El patógeno de poscosecha Penicillium expansum codifica tres AFPs, siendo PeAfpA la que presenta mayor actividad. En esta tesis profundizamos en el modo de acción de PeAfpA frente a Saccharomyces cerevisiae y el principal patógeno de poscosecha de cítricos, Penicillium digitatum. Además, caracterizamos estructuralmente PeAfpB y exploramos la viabilidad de la ingeniería de proteínas con AFPs para identificar determinantes antifúngicos y modular sus propiedades. Combinamos un análisis transcriptómico con un cribado de mutantes de deleción de S. cerevisiae y estudios de biología celular para estudiar el mecanismo de acción de PeAfpA frente a levaduras. La pared celular resultó ser importante para la actividad anti-levadura de PeAfpA, la cual es capaz de penetrar en la levadura mediante mecanismos dependientes e independientes de energía. Además, la defensa de la levadura parece depender del metabolismo del fosfatidilinositol y del gen ROX3. Utilizamos P. digitatum para investigar el modo de acción de PeAfpA contra hongos filamentosos y descubrimos que se diferencia de otras AFPs en que no promueve la producción de especies reactivas de oxígeno. Los estudios de microscopía revelaron una dinámica compleja de unión e internalización de PeAfpA, mostrando un patrón de unión punteado en conidios quiescentes que cambiaba durante la germinación a una distribución uniforme y más intensa. La melanina resultó ser un factor importante en este proceso. PeAfpA solo se internalizó en hifas, adhiriéndose y penetrando preferentemente a través del ápice. La internalización se produjo mediante un proceso no endocítico pero dependiente de energía y se observó que la manosilación de proteínas determina la actividad de las AFPs en P. digitatum. Para descubrir determinantes antifúngicos de las AFPs, resolvimos la estructura de PeAfpB, que permitió el diseño racional y la producción biotecnológica de proteínas quiméricas PeAfpA::PeAfpB. Las quimeras chPeAFPV1 y chPeAFPV6 se diferenciaban de PeAfpB en uno y dos aminoácidos, respectivamente, que afectaban al motivo conservado gamma-core. Estas quimeras fueron las más potentes, confirmando la relevancia del motivo gamma-core para su actividad. Por otro lado, chPeAFPV3 y chPeAFPV7 eran prácticamente inactivas, lo que evidencia el papel crucial del bucle L3 para su actividad. También demostramos que la unión a lípidos está parcialmente correlacionada con la actividad antifúngica. La mayoría de las proteínas activas mostraron afinidad por fosfolípidos, a diferencia de las inactivas, lo que subraya el papel de L3 en la capacidad de unión a lípidos. La permeabilización de membrana se detectó tras la internalización y se correlacionó con la actividad antifúngica. Estudios posteriores deberán confirmar si la permeabilización forma parte del mecanismo de acción o si es consecuencia de la muerte celular. El comportamiento diferencial de las quimeras se atribuyó a cambios en aminoácidos específicos y no a una reorganización de su estructura general. Por último, demostramos que PeAfpA, PeAfpB y las quimeras no son tóxicas frente a Galleria mellonella. Además, PeAfpA pudo unirse a la pared celular de Candida auris, penetrar y matar al patógeno, evidenciando su potencial biomédico. En resumen, esta tesis amplía el conocimiento sobre el modo de acción de las AFPs, posiciona a PeAfpA como una candidata prometedora para diversas aplicaciones y valida el potencial de las AFPs para el diseño racional y producción recombinante de nuevas proteínas antifúngicas con atributos modificados.

[CA] Els fongs patògens són un risc per a la salut i la seguretat alimentària a causa de les infeccions fúngiques i l'aparició de soques multirresistents. Les proteïnes antifúngiques (AFPs) són catiòniques, riques en cisteïna, secretades per fongs filamentosos i emergeixen com una alternativa prometedora per al desenvolupament de nous antifúngics, gràcies a les seues propietats fisicoquímiques, activitat d'ampli espectre i no toxicitat. El patogen postcollita Penicillium expansum codifica tres AFPs, sent PeAfpA la de major activitat. En aquesta tesi aprofundim en el mode d'acció de PeAfpA davant de Saccharomyces cerevisiae i el principal patogen postcollita de cítrics, Penicillium digitatum. A més a més, caracteritzem estructuralment PeAfpB i explorem la viabilitat de l'enginyeria de proteïnes amb AFPs per a identificar determinants antifúngics i modular les seues propietats. Hem combinat una anàlisi transcriptòmica amb un cribratge de mutants de deleció de S. cerevisiae i estudis de biologia cel·lular per a estudiar el mecanisme d'acció de PeAfpA davant de llevats. La paret cel·lular va resultar ser important per a l'activitat anti-llevat de PeAfpA, la qual és capaç de penetrar en el llevat per mecanismes dependents i independents d'energia. A més a més, la defensa del llevat sembla dependre del metabolisme del fosfatidilinositol i del gen ROX3. Vam utilitzar P. digitatum per a investigar el mode d'acció de PeAfpA contra fongs filamentosos i vam descobrir que es diferencia d'altres AFPs en què no promou la producció d'espècies reactives d'oxigen. Els estudis de microscòpia van revelar una dinàmica complexa d'unió i internalització de PeAfpA, mostrant un patró d'unió puntejat en conidis quiescents que canviava durant la germinació a una distribució uniforme i més intensa. La melanina va resultar ser un factor important en aquest procés. PeAfpA només es va internalitzar en hifes, adherint-se i penetrant preferentment a través de l'àpex. La internalització es va produir per un procés no endocític però dependent d'energia i es va observar que la manosilació de proteïnes determina l'activitat de les AFPs en P. digitatum. Per a descobrir determinants antifúngics de les AFPs, vam resoldre l'estructura de PeAfpB, que va permetre el disseny racional i la producció biotecnològica de proteïnes quimèriques PeAfpA::PeAfpB. Les quimeres chPeAFPV1 i chPeAFPV6 es diferenciaven de PeAfpB en aminoàcids que afectaven el motiu conservat gamma-core. Aquestes quimeres van ser les més potents, confirmant la rellevància del motiu gamma-core per a la seua activitat. D'altra banda, chPeAFPV3 i chPeAFPV7 eren pràcticament inactives, la qual cosa evidencia el paper del bucle L3 per a la seua activitat. També vam demostrar que l'unió a lípids està parcialment correlacionada amb l'activitat antifúngica. La majoria de les proteïnes actives van mostrar afinitat per fosfolípids, a diferència de les inactives, la qual cosa subratlla el paper de L3 en la capacitat d'unió a lípids. La permeabilització de membrana es va detectar després de la internalització i es va correlacionar amb l'activitat antifúngica. Estudis posteriors hauran de confirmar si la permeabilització forma part del mecanisme d'acció o si és conseqüència de la mort cel·lular. El comportament diferencial de les quimeres es va atribuir a canvis en aminoàcids específics i no a una reorganització de la seua estructura general. Finalment, vam demostrar que PeAfpA, PeAfpB i les quimeres no són tòxiques davant de Galleria mellonella. A més a més, PeAfpA va ser capaç d'unir-se a la paret cel·lular de Candida auris, penetrar i matar el patogen, evidenciant el seu potencial biomèdic. En resum, aquesta tesi eixampla el coneixement sobre el mode d'acció de les AFPs, posiciona PeAfpA com una candidata prometedora per a diverses aplicacions i valida el potencial de les AFPs per al disseny racional i producció recombinant de noves proteïnes antifúngiques amb atributs modificats.

[EN] Pathogenic fungi pose a significant risk to human health and food security due to fungal infections and the emergence of multidrug-resistant strains. Antifungal proteins (AFPs) are cationic, cysteine-rich proteins secreted by filamentous fungi that have emerged as a promising alternative for the development of new antifungals, due to their physicochemical properties, broad-spectrum activity, and non-toxicity. The postharvest pathogen Penicillium expansum encodes three AFPs, with PeAfpA exhibiting the highest activity. This thesis delves into the mode of action of PeAfpA against Saccharomyces cerevisiae and the primary citrus post-harvest pathogen, Penicillium digitatum. Additionally, we structurally characterise PeAfpB and explore the feasibility of protein engineering with AFPs to identify antifungal determinants and modulate their properties. We combined a transcriptomic analysis with a deletion mutant screen of S. cerevisiae and cell biology studies to investigate the mechanism of action of PeAfpA against yeasts. The cell wall was found to be important for the anti-yeast activity of PeAfpA, which is capable of penetrating yeast cells through energy-dependent and independent mechanisms. Furthermore, yeast defense appears to rely on phosphatidylinositol metabolism and the ROX3 gene. We used P. digitatum to investigate the mode of action of PeAfpA against filamentous fungi and discovered that it differs from other AFPs in that it does not promote the production of reactive oxygen species. Microscopy studies revealed a complex dynamics of binding and internalisation of PeAfpA, showing a punctate binding pattern in quiescent conidia that changed during germination to a more uniform and intense distribution. Melanin was found to be an important factor in this process. PeAfpA was only internalised in hyphae, adhering to and penetrating preferentially through the apex. Internalisation occurred through a non-endocytic but energy-dependent process, and it was observed that protein mannosylation determines the activity of AFPs in P. digitatum. To uncover antifungal determinants of AFPs, we solved the structure of PeAfpB, which allowed the rational design and biotechnological production of PeAfpA::PeAfpB chimeric proteins. The chimeras chPeAFPV1 and chPeAFPV6 differed from PeAfpB by one and two amino acids, respectively, which affected the conserved gamma-core motif. These chimeras were the most potent, confirming the relevance of the gamma-core motif for their activity. On the other hand, chPeAFPV3 and chPeAFPV7 were practically inactive, evidencing the crucial role of the L3 loop for their activity. We also demonstrated that lipid binding is partially correlated with antifungal activity. Most active proteins showed affinity for phospholipids, unlike the inactive ones, underlining the role of L3 in lipid binding capacity. Membrane permeabilisation was detected after internalisation and correlated with antifungal activity. Further studies should confirm whether permeabilisation is part of the mechanism of action or a consequence of cell death. The differential behavior of the chimeras was attributed to changes in specific amino acids and not to a reorganisation of their overall structure. Finally, we demonstrated that PeAfpA, PeAfpB, and the chimeras are not toxic to Galleria mellonella. Additionally, PeAfpA was able to bind to the cell wall of Candida auris, penetrate and kill the pathogen, evidencing its biomedical potential. In summary, this thesis significantly advances our understanding of the mode of action of AFPs, positions PeAfpA as a promising candidate for various applications, and validates the potential of AFPs for the rational design and recombinant production of new antifungal proteins with modified attributes.

Tesis por compendio