New Approaches in the Genetic Diagnosis of Inherited Retinal Dystrophies and Future Therapeutic Insights

[ES] Las distrofias hereditarias de retina (DHR) son un grupo de enfermedades genéticas que afectan los fotorreceptores y el epitelio pigmentario, causando pérdida progresiva de la visión. Su diagnóstico es complejo debido a la gran heterogeneidad genética y clínica, con más de 280 genes asociados. La secuenciación de nueva generación o High-throughput Sequencing (HTS) ha revolucionado el diagnóstico, permitiendo identificar variantes genéticas y facilitar el acceso a terapias génicas. La primera parte de la tesis estudió 92 pacientes con DHR utilizando paneles genéticos personalizados. Se identificó la causa genética en el 57,6% de los casos, mientras que el 13% tenía solo una mutación en genes autosómicos recesivos y el 29,3% quedó sin diagnóstico. Se hallaron 120 variantes patogénicas o probablemente patogénicas, incluidas 30 nuevas. Los genes ABCA4 y USH2A fueron los más comúnmente mutados en distintos tipos de DHR. La inclusión de regiones no codificantes permitió identificar variantes intrónicas profundas, destacando su importancia en el diagnóstico genético. La segunda parte de la tesis analizó variantes intrónicas profundas en el gen USH2A en pacientes con síndrome de Usher (USH) y retinosis pigmentaria (RP) autosómica recesiva sin diagnóstico completo. Se cribaron cinco variantes previamente descritas en pacientes con una sola mutación en USH2A, logrando completar el diagnóstico en el 30,95% de los casos. Se identificaron 16 variantes con posible impacto en el splicing, y cuatro de ellas se confirmaron funcionalmente mediante ensayos con minigenes. Además, se desarrollaron oligonucleótidos antisentido (ASO) que corrigieron con éxito la inclusión de pseudoexones en tres variantes intrónicas profundas de USH2A, mostrando su potencial terapéutico. Finalmente, la tercera parte de la tesis estudió el síndrome oro-facial-digital (OFD) tipo IX, una ciliopatía vinculada a mutaciones en el gen TBC1D32. Se identificaron dos variantes en trans en un paciente con RP e hipoacusia neurosensorial bilateral (SNHL), lo que sugiere que la SNHL podría formar parte del espectro clínico de OFD tipo IX. Este hallazgo resalta la necesidad de estudios genéticos y clínicos en pacientes con fenotipos complejos. En conclusión, la investigación resalta la importancia del análisis de regiones codificantes y no codificantes en el diagnóstico de DHR. También demuestra cómo la HTS y herramientas como los ASO pueden mejorar el diagnóstico y abrir nuevas vías terapéuticas personalizadas para pacientes con variantes genéticas ultra raras.

[CA] Les distròfies hereditàries de retina (DHR) són malalties genètiques que afecten els fotoreceptors i l'epiteli pigmentari, provocant una pèrdua progressiva de la visió. El seu diagnòstic és complex per la gran heterogeneïtat genètica i clínica, amb més de 280 gens associats. La seqüenciació de nova generació o High-throughput Sequencing (HTS) ha revolucionat el diagnòstic, permetent identificar variants genètiques i facilitant l'accés a teràpies gèniques. La primera part de la tesi va estudiar 92 pacients amb DHR mitjançant panells genètics personalitzats. Es va identificar la causa genètica en el 57,6% dels casos, mentre que el 13% tenia només una mutació en gens autosòmics recessius i el 29,3% es va quedar sense diagnòstic. Es van trobar 120 variants patogèniques o probablement patogèniques, incloent-ne 30 de noves. Els gens ABCA4 i USH2A van ser els més freqüentment mutats en diferents tipus de DHR. La inclusió de regions no codificants va permetre identificar variants intròniques profundes, destacant la seua importància en el diagnòstic genètic. La segona part de la tesi va analitzar variants intròniques profundes en el gen USH2A en pacients amb síndrome de Usher (USH) i retinosi pigmentària (RP) autosòmica recessiva sense diagnòstic complet. Es van estudiar cinc variants intròniques prèviament descrites en pacients amb una sola mutació en USH2A, completant el diagnòstic en el 30,95% dels casos. Es van identificar 16 variants amb possible alteració del splicing, de les quals quatre es van confirmar funcionalment amb assajos amb minigens. A més, es van dissenyar oligonucleòtids antisentit (ASO) que van corregir amb èxit la inclusió de pseudoexons en tres variants intròniques profundes de USH2A, mostrant el seu potencial terapèutic. Finalment, la tercera part de la tesi va estudiar el síndrome oro-facial-digital (OFD) tipus IX, una ciliopatia associada a mutacions en el gen TBC1D32. Es van identificar dues variants en trans en un pacient amb RP i hipoacúsia neurosensorial bilateral (SNHL), suggerint que la SNHL podria formar part de l'espectre clínic de OFD tipus IX. Aquest descobriment subratlla la necessitat d'estudis genètics i clínics en pacients amb fenotips complexos. En conclusió, la investigació destaca la importància d'analitzar regions codificants i no codificants en el diagnòstic de DHR. També demostra com la HTS i eines com els ASO poden millorar el diagnòstic i obrir noves vies terapèutiques personalitzades per a pacients amb variants genètiques ultra rares.

[EN] Inherited retinal dystrophies (IRD) are genetic disorders affecting photoreceptors and retinal pigment epithelium cells, leading to progressive vision loss. Their genetic diagnosis is challenging due to significant genetic and clinical heterogeneity, with over 280 associated genes. High-throughput sequencing (HTS) has revolutionized the diagnostic process, improving variant identification and providing patients with genetic counseling and access to gene therapy trials. The first study analyzed 92 IRD patients using custom gene panels, identifying the genetic cause in 57.6% of cases. Among them, 13% had only one mutation in autosomal recessive genes, while 29.3% remained undiagnosed. A total of 120 pathogenic or likely pathogenic variants were found, including 30 novel ones. ABCA4 was the most frequently mutated gene in cone-rod dystrophy, whereas USH2A mutations were most common in retinitis pigmentosa (RP). The inclusion of non-coding regions allowed the identification of deep-intronic variants in ABCA4 and CEP290, reinforcing the importance of these regions in genetic diagnostics. This approach enabled molecular diagnosis for many patients, helping them make reproductive decisions and access gene therapy clinical trials. The second study focused on deep-intronic variants in USH2A in unresolved Usher syndrome (USH) and autosomal recessive RP cases. Five previously reported pathogenic variants were screened in monoallelic patients, leading to a complete diagnosis in 30.95% of them. Further sequencing of USH2A or all USH genes revealed 16 variants affecting splicing, of which four were confirmed functionally. Two newly discovered variants caused pseudoexon (PE) inclusion in pre-mRNA, while two others affected a regulatory cis-element. Antisense oligonucleotides (ASOs) were designed to correct PE inclusion in three deep-intronic USH2A variants, successfully restoring normal splicing in vitro, demonstrating the therapeutic potential of ASOs. The third study examined oro-facial-digital syndrome (OFD) type IX, a ciliopathy linked to TBC1D32 mutations. A patient presenting OFD type IX features, RP, and bilateral sensorineural hearing loss (SNHL) underwent clinical exome sequencing, which identified two heterozygous TBC1D32 variants in trans. As this was the first reported case of SNHL associated with TBC1D32 mutations, additional analyses of SNHL-related genes were conducted, but no disease-causing variants were found. Given the role of ciliary dysfunction in hearing loss, SNHL could be considered an additional symptom of OFD type IX. This highlights the importance of genetic and clinical evaluations in complex phenotypes. In conclusion, this research underscores the need to analyze both coding and non-coding regions to improve IRD diagnosis. It also demonstrates how HTS and tools like ASOs can advance personalized treatments, offering hope for patients with ultra-rare variants. A thorough clinical anamnesis and case review are essential for achieving accurate genetic diagnoses and ensuring proper patient follow-up.

Tesis por compendio