Biotechnological Plant Platforms for the Production of Saffron Apocarotenoids

[ES] La especia de azafrán es altamente valorada por la acumulación de apocarotenoides bioactivos, incluyendo crocinas, picrocrocina y safranal. Las dificultades del cultivo de Crocus sativus y otras especies vegetales que acumulan apocarotenoides del azafrán limita la producción comercial de estos valiosos metabolitos. Esta tesis explora estrategias biotecnológicas para la producción sostenible y escalable de apocarotenoides del azafrán utilizando tomate transgénico y cultivos de suspensiones celulares vegetales. En primer lugar, se ha evaluado y optimizado el Tomafrán, una plataforma de tomate transgénico diseñada para acumular apocarotenoides del azafrán, como una plataforma alternativa para la producción y almacenamiento de estos metabolitos. Los productos procesados del fruto de Tomafrán retuvieron o incluso aumentaron su contenido en apocarotenoides, mostrando niveles estables de crocinas y propiedades sensoriales similares a las del azafrán, resaltando su potencial para aplicaciones alimentarias. Posteriormente, optimizamos el Tomafrán mediante la edición de los genes self-pruning (SP) y self-pruning 5g (SP5G) con CRISPR/Cas9, generando dobles mutantes sp sp5g que mostraron un alto rendimiento y una mayor acumulación de crocinas, siendo aptos para la cosecha mecanizada. En segundo lugar, se han optimizado los niveles de producción de apocarotenoides del azafrán en el fruto. La primera estrategia consistió en introducir la dioxigenasa de escisión de carotenoides 2 de C. sativus (CsCCD2) en una planta de tomate mutante que acumula altos niveles de zeaxantina, el sustrato de CCD2, en el fruto maduro. En la segunda estrategia, se introdujo el gen CCD4a de Gardenia jasminoides (GjCCD4a) en plantas mutantes que acumulan altos niveles de ß-caroteno y zeaxantina en el fruto maduro. GjCCD4a tiene una especificidad más amplia que CsCCD2, usando zeaxantina y ß-caroteno como sustratos para producir crocinas. La expresión de GjCCD4a aumentó aún más la producción de crocinas, alcanzando los rendimientos más altos reportados en un sistema heterólogo, revelando un cambio metabólico en la composición de carotenoides y alterando el perfil de volátiles. En tercer lugar, se han establecido cultivos de suspensiones celulares vegetales transgénicas de especies de Nicotiana que expresan CsCCD2 y GjCCD4a, junto con genes que mejoran la acumulación de carotenoides, para optimizar la producción de apocarotenoides. Las células BY-2 que expresan GjCCD4a acumularon altos niveles de crocinas, los cuales aumentaron tras la elicitación con jasmonato de metilo. Además, el perfil de carotenoides y volátiles en las células se vio totalmente alterado, demostrando cambios metabólicos más amplios. El cultivo de estas células en biorreactores de onda demostró la viabilidad de este sistema para escalar la producción de apocarotenoides del azafrán de manera aséptica y contenida. En conjunto, esta tesis impulsa el desarrollo de plataformas de producción de apocarotenoides del azafrán basadas en plantas, proporcionando alternativas sostenibles para su uso en las industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética.

[CA] L'espècia de safrà és altament valorada per l'acumulació d'apocarotenoides bioactius, incloent crocines, picrocrocina i safranal. Les dificultats del cultiu de Crocus sativus i altres espècies vegetals que acumulen aquests apocarotenoides limiten la producció comercial d'aquests valuosos metabolits. Aquesta tesi explora estratègies biotecnològiques per a la producció sostenible i escalable d'apocarotenoides del safrà utilitzant tomàquet transgènic i cultius de suspensions cel·lulars vegetals. En primer lloc, s'ha avaluat i optimitzat el Tomafrà, una plataforma de tomàquet transgènic dissenyada per acumular apocarotenoides del safrà, com una plataforma alternativa per a la producció i emmagatzematge d'aquests metabolits. Els productes processats del fruit de Tomafrà van retenir o fins i tot augmentar el seu contingut en apocarotenoides, mostrant nivells estables de crocines i propietats sensorials similars a les del safrà, destacant així el seu potencial per a aplicacions alimentàries. Posteriorment, vam optimitzar la planta de Tomafrà mitjançant l'edició dels gens self-pruning (SP) i self-pruning 5g (SP5G) amb CRISPR/Cas9, generant dobles mutants sp sp5g que van mostrar un alt rendiment i una major acumulació de crocines, sent aptes per a una collita mecanitzada. En segon lloc, s'han optimitzat els nivells de producció d'apocarotenoides del safrà en el fruit. La primera estratègia va consistir en introduir la dioxigenasa d'escissió de carotenoides 2 de C. sativus (CsCCD2) en una planta de tomàquet mutada que acumula alts nivells de zeaxantina, el substrat de CCD2, en el fruit madur. En la segona estratègia, es va introduir el gen CCD4a de Gardenia jasminoides (GjCCD4a) en plantes mutades que acumulen alts nivells de ß-caroté i zeaxantina en el fruit madur. GjCCD4a té una especificitat més àmplia que CsCCD2, utilitzant zeaxantina i ß-caroté com a substrats per a produir crocines. L'expressió de GjCCD4a va augmentar encara més la producció de crocines, aconseguint els rendiments més alts reportats en un sistema heteròleg, revelant un canvi metabòlic en la composició de carotenoides i alterant el perfil de volàtils. En tercer lloc, s'han establert cultius de suspensions cel·lulars vegetals transgèniques d'espècies de Nicotiana que expressen CsCCD2 i GjCCD4a, juntament amb gens que milloren l'acumulació de carotenoides, per optimitzar la producció d'apocarotenoides. Les cèl·lules BY-2 que expressen GjCCD4a van acumular alts nivells de crocines, els quals van augmentar després de l'elicitació amb jasmonat de metil. A més, el perfil de carotenoides i volàtils en les cèl·lules es va veure totalment alterat, demostrant canvis metabòlics més amplis. El cultiu d'aquestes cèl·lules en biorreactors d'ona va demostrar la viabilitat d'aquest sistema per escalar la producció d'apocarotenoides del safrà de manera asèptica i contenciosa. En conjunt, aquesta tesi impulsa el desenvolupament de plataformes de producció d'apocarotenoides del safrà basades en plantes, proporcionant alternatives sostenibles per al seu ús en les indústries alimentària, farmacèutica i cosmètica.

[EN] Saffron spice is highly valued for accumulating its bioactive apocarotenoids, including crocins, picrocrocin, and safranal. The labor-intensive cultivation of Crocus sativus and other plant species that accumulate saffron apocarotenoids constrains the commercial production of these valuable metabolites. This thesis explores biotechnological strategies for the sustainable and scalable production of saffron apocarotenoids using transgenic tomato and plant cell suspension cultures. First, we evaluated and optimized Tomaffron, a transgenic tomato platform engineered to accumulate saffron apocarotenoids, as an alternative platform for producing and storing these metabolites. Processed Tomaffron products retained or even increased their apocarotenoid content, with stable crocin levels and enhanced saffron-like sensory properties, highlighting their potential for food applications. Next, we optimized Tomaffron by CRISPR/Cas9 editing of the self-pruning (SP) and self-pruning 5g (SP5G) genes, generating high-yielding sp sp5g double mutants with increased crocin accumulation and suitability for mechanized harvesting. Second, we optimized the production levels of saffron apocarotenoid in tomato fruit. The first approach involved introducing the carotenoid cleavage dioxygenase 2 from C. sativus (CsCCD2) into a mutant tomato plant that accumulates high levels of zeaxanthin, which is the CCD2 carotenoid substrate, on the fruits. In the second approach, we used the CCD4a from Gardenia jasminoides (GjCCD4a) in mutant plants that accumulate high levels of ß-carotene and zeaxanthin in the fruit. GjCCD4a has a broader carotenoid specificity, using zeaxanthin and ß-carotene as substrates to produce crocins. GjCCD4a further enhanced crocin production, reaching the highest reported yields in a heterologous system, while also inducing a metabolic shift in carotenoid composition and altering the volatile profile. Third, we established transgenic Nicotiana species plant cell suspensions expressing CsCCD2 and GjCCD4a along with carotenoid-enhancing genes to optimize apocarotenoid production. BY-2 cells expressing GjCCD4a accumulated high levels of crocins, which increased upon methyl jasmonate elicitation. In addition to the increase in apocarotenoid production, the carotenoid and volatile profiles of these cells were significantly altered, demonstrating broader metabolic shifts. Culturing these cells in wave bioreactors demonstrated the feasibility of this system for upscaling and producing saffron apocarotenoids in a sterile and contained manner. Collectively, this thesis advances plant-based production platforms for saffron apocarotenoids, providing sustainable alternatives for the food, pharmaceutical, and cosmetic industries.