Exploring the Contribution of Neutrophil Extracellular Traps to Bladder Cancer Progression and a Hypercoagulable Environment

[ES] El cáncer de vejiga (CV) es un proceso oncológico complejo influido no solo por factores intrínsecos del tumor, sino también por el microambiente tumoral, incluyendo células inmunitarias como los neutrófilos. Los neutrófilos, elementos clave del sistema inmunitario, también favorecen el desarrollo tumoral mediante la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs, por sus siglas en inglés) en un proceso denominado NETosis. Los NETs son redes extracelulares compuestos por ADN, histonas y proteínas citoplasmáticas y granulares (como calprotectina, mieloperoxidasa, elastasa, entre otras) liberadas por los neutrófilos tras su activación. Estas estructuras regulan el crecimiento tumoral al tiempo que promueven la angiogénesis y la invasividad, y las propias células tumorales pueden estimular la NETosis. Sin embargo, este fenómeno no había sido evidenciado previamente en pacientes con CV. Esta tesis explora el papel multifacético de los neutrófilos a través de la NETosis en el CV, centrándose en su contribución a la progresión tumoral, la resistencia a la quimioterapia y la promoción de un entorno hipercoagulable. En el primer capítulo, demostramos por primera vez que los pacientes con CV presentan una NETosis aumentada tanto a nivel sistémico como en el microambiente tumoral, especialmente en los subtipos músculo-infiltrantes. Este fenómeno se debe en parte a una degradación deficiente de los NETs mediada por la DNasa I, un defecto que demostramos puede revertirse terapéuticamente in vitro mediante el uso de DNasa I humana recombinante (Dornasa alfa, Pulmozyme®, Roche). En el segundo capítulo investigamos los efectos protrombóticos y protumorales de las NETs. Mostramos que las células de CV promueven la generación de trombina a través de la expresión del factor tisular (TF), y que los NETs, especialmente los derivados de pacientes con CV, potencian la proliferación e invasión de células de CV de alto grado, además de modular la secreción de citocinas. Estos hallazgos sugieren un papel sinérgico entre los NETs y las células tumorales en la promoción de un fenotipo tumoral procoagulante y agresivo. En el tercer capítulo, utilizamos modelos de cultivo tridimensional (esferoides) de células de CV para imitar mejor el microambiente tumoral y evaluar el impacto de los neutrófilos en la respuesta a la quimioterapia. Nuestros resultados revelan que los neutrófilos, a través de la formación de NETs, reducen la eficacia del cisplatino y la gemcitabina, lo que sugiere un papel de los NETs en la quimiorresistencia. Finalmente, en el cuarto capítulo, exploramos la heterogeneidad de las subpoblaciones de neutrófilos en el CV. Los neutrófilos de baja densidad, conocidos por su fenotipo protumoral, presentan tasas de NETosis más altas y rápidas cuando proceden de pacientes con CV en comparación con los de los controles. Estos hallazgos subrayan la importancia de los subtipos de neutrófilos en la configuración de las funciones promotoras de tumor de las NETs. En conjunto, este trabajo destaca la relevancia patológica de los NETs en el CV e identifica su potencial como dianas terapéuticas para mitigar la progresión tumoral, la resistencia al tratamiento y, probablemente, la trombosis asociada al cáncer.

[CA] El càncer de bufeta (CB) és un procés oncològic complex, influït no sols per factors intrínsecs del tumor, sinó també pel microambient tumoral, on s’inclouen cèl·lules immunitàries com els neutròfils. Els neutròfils, elements clau del sistema immunitari, també poden afavorir el desenvolupament tumoral mitjançant la formació de trampes extracel·lulars de neutròfils (NETs, per les seues sigles en anglès) en un procés anomenat NETosi. Els NETs són xarxes extracel·lulars compostes per ADN, histones i proteïnes citoplasmàtiques i granulars (com la calprotectina, la mieloperoxidasa o l’elastasa, entre altres) que els neutròfils alliberen després de la seua activació. Aquestes estructures poden regular el creixement tumoral i, alhora, promoure l’angiogènesi i la invasivitat; a més, les mateixes cèl·lules tumorals poden estimular la NETosi. No obstant això, aquest fenomen no havia sigut evidenciat prèviament en pacients amb CB. Aquesta tesi explora el paper multifacètic dels neutròfils a través de la NETosi en el CB, centrant-se en la seua contribució a la progressió tumoral, la resistència a la quimioteràpia i la promoció d’un entorn hipercoagulable. En el primer capítol, demostrem per primera vegada que els pacients amb CB presenten una NETosi augmentada tant a nivell sistèmic com en el microambient tumoral, especialment en els subtipus múscul-infiltrants. Aquest increment es deu, en part, a una degradació deficient dels NETs mediada per la DNasa I, un defecte que mostrem que pot revertir-se terapèuticament in vitro mitjançant l’ús de DNasa I humana recombinant (dornasa alfa; Pulmozyme®, Roche). En el segon capítol, investiguem els efectes protrombòtics i protumorals dels NETs. Mostrem que les cèl·lules de CB promouen la generació de trombina a través de l’expressió del factor tissular (TF), i que els NETs —especialment els derivats de pacients amb CB— potencien la proliferació i la invasió de cèl·lules de CB d’alt grau, a més de modular la secreció de citocines. Aquests resultats suggereixen un paper sinèrgic entre els NETs i les cèl·lules tumorals en la promoció d’un fenotip tumoral procoagulant i agressiu. En el tercer capítol, utilitzem models de cultiu tridimensional (esferoides) de cèl·lules de CB per imitar millor el microambient tumoral i avaluar l’impacte dels neutròfils en la resposta a la quimioteràpia. Els nostres resultats revelen que els neutròfils, a través de la formació de NETs, redueixen l’eficàcia del cisplatí i la gemcitabina, la qual cosa suggereix un paper dels NETs en la quimioresistència. Finalment, en el quart capítol, explorem l’heterogeneïtat de les subpoblacions de neutròfils en el CB. Els neutròfils de baixa densitat, coneguts pel seu fenotip protumoral, presenten taxes de NETosi més altes i més ràpides quan s’aïllen de pacients amb CB en comparació amb els controls. Aquests resultats subratllen la importància dels subtipus de neutròfils en la configuració de les funcions promotores de tumor dels NETs. En conjunt, aquest treball destaca la rellevància patològica dels NETs en el CB i identifica el seu potencial com a dianes terapèutiques per mitigar la progressió tumoral, la resistència al tractament i, probablement, la trombosi associada al càncer.

[EN] Bladder cancer (BC) is a complex malignancy influenced not only by tumour-intrinsic factors but also by the tumour microenvironment, including immune cells such as neutrophils. Neutrophils, key players of the immune system, also promote tumour development through the formation of neutrophil extracellular traps (NETs) in a process called NETosis. NETs are extracellular networks of DNA, histones and cytoplasmic and granular proteins (calprotectin, myeloperoxidase, elastase, etc.) released by neutrophils upon activation. NETs regulate tumour growth while promoting angiogenesis and invasiveness, and tumour cells also stimulate NETosis. However, this had never been evidenced in BC patients. This thesis explores the multifaceted role of neutrophils through NETosis in BC, focusing on their contribution to tumour progression, resistance to chemotherapy and to the promotion of a hypercoagulable environment. In the first chapter, we demonstrate for the first time that BC patients exhibit increased NETosis both systemically and within the tumour microenvironment, particularly in muscle-invasive subtypes. This phenomenon is partly driven by impaired DNaseI-mediated NET degradation, a defect that we demonstrate to be therapeutically reversed in vitro using recombinant human DNaseI (Dornase alfa, Pulmozyme®, Roche). The second chapter investigates the pro-thrombotic and pro-tumoural effects of NETs. We show that BC cells promote thrombin generation via tissue factor (TF) expression and that NETs, especially those derived from BC patients, enhance proliferation and invasion of high-grade BC cells while modulating cytokine secretion. These findings suggest a synergistic role of NETs and BC tumour cells in promoting a procoagulant and aggressive tumour phenotype. In the third chapter, we employed 3D spheroid BC cell culture models to better mimic the tumour microenvironment and assess the impact of neutrophils on chemotherapy response. Our results reveal that neutrophils, through NET formation, reduce the efficacy of cisplatin and gemcitabine, suggesting a role for NETs in chemoresistance. Finally, in the fourth chapter, we explore the heterogeneity of neutrophil subpopulations in BC. Low-density neutrophils, known for their pro-tumoural phenotype, exhibit higher and faster NETosis rates when isolated from BC patients compared to those from controls. These findings suggest the importance of neutrophil subtypes in shaping the tumour-promoting functions of NETs. Collectively, this work underscores the pathological relevance of NETs in BC and identifies them as potential therapeutic targets to mitigate tumour progression, treatment resistance and probably cancer-associated thrombosis.