Transcriptomic and genetic insights into the function and mechanism of the antifungal proteins PeAfpA and PdAfpB

[ES] Los hongos fitopatógenos representan una grave amenaza para la seguridad alimentaria, agravada por la creciente resistencia a los antifúngicos convencionales. Las proteínas antifúngicas (AFPs) producidas por hongos filamentosos son proteínas pequeñas, catiónicas y ricas en cisteínas que destacan por su amplio espectro, baja toxicidad y potencial biotecnológico. El patógeno postcosecha de frutos cítricos Penicillium digitatum codifica una única AFP, PdAfpB, mientras que el principal patógeno postcosecha de frutas de pepita, Penicillium expansum, codifica tres AFPs (PeAfpA, PeAfpB y PeAfpC). A pesar del potencial de las AFPs para el control postcosecha, se desconocen muchos aspectos de su función biológica, regulación y mecanismos de acción. Esta tesis doctoral investiga el modo de acción de las proteínas antifúngicas PeAfpA y PdAfpB frente a P. digitatum, y explora su función biológica mediante la combinación de análisis transcriptómicos y de genética funcional. El análisis por RNA-Seq en P. digitatum tratado con PdAfpB, junto con un mutante nulo afpB y una cepa sobreproductora, reveló un impacto múltiple del gen afpB. Su deleción tuvo un efecto transcripcional limitado, coherente con la ausencia de producción de la proteína en la cepa parental, y sugiere un papel en la homeostasis celular. Aunque no se detectó PdAfpB en la cepa sobreproductora en las condiciones del ensayo, esta mostró una respuesta transcripcional parcialmente coincidente con la de la cepa parental expuesta a la proteína. Además, se identificó que los genes de la acetolactato sintasa y descarboxilasa, implicados en la biosíntesis de acetoína, contribuyen a la actividad inhibitoria de PdAfpB.

En P. expansum, la caracterización fenotípica y el análisis transcriptómico de mutantes nulos afpA permitieron profundizar en la función de la proteína PeAfpA en su hongo productor. La mutación de afpA no afectó al crecimiento axénico, la conidiación, la virulencia, la respuesta a estrés ni la sensibilidad del hongo a las AFPs producidas por P. expansum. El análisis de RNA-Seq reveló una importante reprogramación transcripcional asociada a la producción de la proteína, incluyendo la activación de genes implicados en la remodelación de la pared celular, el metabolismo de carbohidratos y el transporte a través de la membrana, lo que sugiere una posible respuesta frente a la limitación de nutrientes. Además, se identificó la existencia de co-regulación entre los tres genes afp de P. expansum.

Finalmente, los análisis transcriptómicos revelaron que la exposición de P. digitatum a la proteína exógena PeAfpA desencadena un patrón de expresión con similitudes y diferencias al activado por PdAfpB. PeAfpA activó genes implicados en homeostasis redox y respuesta a estrés, mientras que PdAfpB estimuló genes relacionados con la traducción. Ambas proteínas modularon genes asociados al metabolismo de pared celular y lípidos, y se detectó la represión de genes implicados en la biosíntesis de hidrofobinas y melanina. Solo la melanina resultó crítica para la interacción de PeAfpA con la superficie de los conidios de P. digitatum, demostrando que distintos componentes de la pared celular participan de forma diferencial en la unión a la proteína. Sin embargo, esta interacción diferencial no modificó la sensibilidad de P. digitatum a las AFPs. Asimismo, la deleción de otros genes diferencialmente expresados, incluidos aquellos implicados en metabolismo secundario, metabolismo lipídico, regulación transcripcional y ensamblaje de la pared celular, no modificó la sensibilidad del hongo a las AFPs, lo que apunta a un modo de acción multidiana tanto para PeAfpA como para PdAfpB. Para efectuar estos estudios funcionales se optimizó un protocolo de edición génica mediante CRISPR/Cas9, incrementando la eficiencia de disrupción génica del 10% a más del 80%, lo que proporciona una plataforma eficaz para estudios de genómica funcional en en patógeno de relevancia agronómica P. digitatum.

[CA] Els fongs fitopatògens representen una greu amenaça per a la seguretat alimentària, agreujada per la creixent resistència als antifúngics convencionals. Les proteïnes antifúngiques (AFPs) produïdes per fongs filamentosos són proteïnes menudes, catiòniques i riques en cisteïnes que destaquen pel seu ampli espectre, baixa toxicitat i potencial biotecnològic. El patogen postcollita de fruits cítrics Penicillium digitatum codifica una única AFP, PdAfpB, mentre que el principal patogen postcollita de fruites de pepita, Penicillium expansum, codifica tres AFPs (PeAfpA, PeAfpB i PeAfpC). Tot i el seu interès per al control postcollita, encara es desconeixen molts aspectes de la seua funció i mecanismes d'acció. Aquesta tesi doctoral investiga el mode d'acció de les proteïnes antifúngiques PeAfpA i PdAfpB davant de P. digitatum, i explora la seua funció biològica mitjançant la combinació d'anàlisis transcriptòmiques i de genètica funcional. L'anàlisi per RNA-Seq en P. digitatum tractat amb PdAfpB, junt amb el mutant nul afpB i una soca sobreproductora, va revelar un impacte múltiple del gen afpB. La seua deleció va tindre un efecte transcripcional limitat, coherent amb l'absència de producció de la proteïna en la soca parental, i suggereix un paper en l'homeòstasi cel·lular. Encara que no es va detectar PdAfpB en la soca sobreproductora en les condicions assajades, va mostrar una resposta transcripcional parcialment coincident amb la de la soca parental exposada a la proteïna. A més, es va identificar que els gens de l'acetolactat sintasa i descarboxilasa, implicats en la biosíntesi d'acetoïna, contribueixen a l'activitat inhibidora de PdAfpB.

En P. expansum, la caracterització fenotípica i l'anàlisi transcriptòmica de mutants nuls afpA van permetre aprofundir en la funció de la proteïna PeAfpA en el seu fong productor. La mutació d'afpA no va afectar el creixement axènic, la conidiació, la virulència, la resposta a l'estrès ni la sensibilitat del fong a les AFPs produïdes per P. expansum. L'anàlisi de RNA-Seq va revelar una important reprogramació transcripcional associada a la producció de la proteïna, incloent l'activació de gens implicats en la remodelació de la paret cel·lular, el metabolisme de carbohidrats i el transport a través de la membrana, la qual cosa suggereix una possible resposta davant la limitació de nutrients. A més, es va identificar l'existència de coregulació entre els tres gens afp de P. expansum.

Finalment, les anàlisis transcriptòmiques van revelar que l'exposició de P. digitatum a la proteïna exògena PeAfpA desencadena un patró d'expressió amb similituds i diferències respecte a PdAfpB. PeAfpA va activar gens implicats en l'homeòstasi redox i la resposta a l'estrés, mentre que PdAfpB va estimular gens relacionats amb la traducció. Ambdues proteïnes van modular gens associats al metabolisme de la paret cel·lular i dels lípids, i es va detectar la repressió de gens implicats en la biosíntesi d'hidrofobines i melanina. Només la melanina va resultar crítica per a la interacció de PeAfpA amb la superfície dels conidis de P. digitatum, demostrant que diferents components de la paret cel·lular participen de manera diferencial en la unió a la proteïna. Tanmateix, aquesta interacció diferencial no va modificar la sensibilitat de P. digitatum a les AFPs. Així mateix, la deleció d'altres gens diferencialment expressats, inclosos genes implicats en metabolisme secundari, metabolisme lipídic, regulació transcripcional i assemblatge de la paret cel·lular, no va modificar la sensibilitat del fong a les AFPs, apuntant a un mode d'acció multidiana tant per a PeAfpA com per a PdAfpB. Per a dur a terme aquests estudis funcionals es va optimitzar un protocol d'edició gènica mitjançant CRISPR/Cas9, incrementant l'eficiència de disrupció gènica del 10% a més del 80% en P. digitatum. Aquest increment proporciona una plataforma eficaç per a estudis de genòmica funcional en aquest patogen de rellevància agronòmica.

[EN] Fungal phytopathogens represent a major threat to global food security, a challenge further aggravated by the increasing emergence of resistance to conventional antifungal agents. Antifungal proteins (AFPs) from filamentous fungi are small, cationic, cysteine-rich proteins that have emerged as promising biomolecules for the development of novel antifungal strategies due to their broad antifungal spectrum, physicochemical features, lack of toxicity, and suitability for biotechnological production. The citrus postharvest pathogen Penicillium digitatum encodes one AFP, PdAfpB, while the main pome postharvest pathogen, Penicillium expansum, encodes three different AFPs (PeAfpA, PeAfpB, PeAfpC). Despite the potential of AFPs for postharvest control, many aspects of their biological function, regulation, and killing mechanism remain poorly understood. This doctoral thesis investigates the mode of action of the antifungal proteins PeAfpA and PdAfpB against P. digitatum and explores their biological functions by combining transcriptomics and functional genetic approaches.

Transcriptomic analyses of PdAfpB-treated P. digitatum, a null afpB mutant, and an PdAfpB-overproducing strain revealed a multifaceted impact of afpB on P. digitatum. Deletion of afpB had a limited effect on the transcriptional profile, consistent with the lack of PdAfpB production in the parental strain, and suggested that afpB contributes to overall cellular homeostasis. Although PdAfpB production was not detected in the overproducing strain under the conditions assayed, this strain displayed a transcriptional response partially overlapping with that of the parental strain exposed to exogenous PdAfpB. Additionally, genes coding for acetolactate synthase and acetolactate decarboxylase, which belong to the acetoin biosynthetic pathway, contribute to the inhibitory activity of PdAfpB.

In P. expansum, we provided new insights into the function of PeAfpA through phenotypic characterization and transcriptomic profiling of null afpA mutants. Notably, mutation of afpA did not affect axenic growth, conidiation, virulence, stress responses, or sensitivity to AFPs produced by P. expansum. However, RNA-seq analyses revealed extensive transcriptional reprogramming associated with PeAfpA production, including the activation of genes involved in cell wall remodeling, carbohydrate metabolism, and membrane transport, pointing to a response to nutrient limitation. Furthermore, we uncovered a co-regulation between the three afp genes of P. expansum. Comparative transcriptomic analyses further revealed that exposure of P. digitatum to the foreign PeAfpA elicited a transcriptional program with differences and similarities from that triggered by PdAfpB. PeAfpA induced genes involved in redox maintenance, unfolded protein response, and stress response, whereas PdAfpB significantly activated translation-related genes. Both proteins modulated genes related to cell wall and lipid metabolism, suggesting structural rearrangements of the fungal surface. Strong repression of genes involved in hydrophobin and melanin biosynthesis, key components of the outer conidial surface, was also identified for both AFPs. Only melanin was critical for the interaction of PeAfpA with the conidial cell wall of P. digitatum, indicating protein-specific dependencies in surface interaction that, however, did not determined the fungal tolerance to AFPs. Deletion of AFP-responsive genes linked to secondary metabolism, lipid metabolism, transcriptional regulation, or cell wall assembly did not affect sensitivity to AFPs, pointing to a multifaceted mode of action for both PeAfpA and PdAfpB. To support these functional studies, a CRISPR/Cas9-based genome editing protocol was optimized for P. digitatum, increasing gene disruption efficiency from 10% up to 80%. This methodological improvement provided an efficient platform for functional genomics studies in this relevant phytopathogenic fungus.

Tesis por compendio