Understanding Mechanisms of Plastid Differentiation for Biofortification of Leaves

[ES] Los isoprenoides plastídicos son una familia diversa de compuestos, muchos de los cuales desempeñan funciones clave en la fotosíntesis y la fotoprotección. Entre ellos, los carotenoides y los tocoferoles son potentes antioxidantes que también tienen relevancia nutricional como provitamina A y vitamina E, respectivamente. Las estrategias de biofortificación se han centrado tradicionalmente en mejorar la biosíntesis de estos compuestos, pero promover el desarrollo de estructuras de almacenamiento aparece como una alternativa prometedora para aumentar el contenido y la estabilidad de los isoprenoides plastídicos de interés. Aunque los mecanismos moleculares que regulan la biogénesis del cloroplasto son relativamente bien conocidos, aquellos que controlan la transformación de cloroplastos en cromoplastos u otros plastos almacenadores de metabolitos han sido mucho menos explorados. Esta tesis tiene como objetivo explorar nuevas estrategias de biofortificación basadas en crear nuevos lugares de almacenamiento de carotenoides y tocoferoles en las células vegetales, y aprender de ello en términos de los mecanismos moleculares que sustentan las transiciones plastídicas.

Para abordar este objetivo, se indujo artificialmente la sobreproducción de carotenoides en distintas localizaciones celulares con el fin de determinar si la formación de estructuras de almacenamiento es un proceso programado o una respuesta emergente a la presión metabólica. Los resultados indican que la acumulación excesiva de carotenoides, incluso fuera de los plastos, supera los límites de solubilidad y desencadena una reorganización espontánea de la arquitectura celular, con la formación de nuevas membranas y compartimentos lipídicos. Estos hallazgos sugieren que los plastos almacenadores no responden necesariamente a un programa de desarrollo rígido, sino que pueden surgir como consecuencia fisicoquímica del exceso metabólico.

En una segunda aproximación, se empleó un enfoque de biología química para inducir plastos almacenadores a partir de cloroplastos mediante el uso de la pequeña molécula X57. Este compuesto incrementa el contenido de tocoferoles combinando efectos de inducción biosintética, redistribución de precursores y aumento de la capacidad de almacenamiento a través de la proliferación de plastoglóbulos. El tratamiento con X57 provoca la conversión reversible de cloroplastos en plastos ricos en tocoferoles, lo que permitió analizar de forma controlada los procesos de desdiferenciación y rediferenciación plastídica.

Finalmente, se demostró que X57 actúa inhibiendo la fosfatasa SAL1, lo que conduce a la acumulación de la señal retrógrada PAP y a la represión de factores clave de la identidad del cloroplasto, como GLK1, junto con una reducción en los niveles de citocininas. Esta modulación regulatoria debilita la identidad fotosintética del plasto y lo predispone a reorganizarse hacia funciones de almacenamiento en respuesta a la acumulación de metabolitos. En conjunto, los resultados muestran que la diferenciación plastídica emerge de la interacción entre presión metabólica y control regulatorio, revelando una plasticidad estructural y funcional mayor de la previamente asumida.

[EN] Plastidial isoprenoids are a diverse family of compounds, many of which play key roles in photosynthesis and photoprotection. Among them, carotenoids and tocopherols are potent antioxidants with nutritional relevance as provitamin A and vitamin E, respectively. Biofortification strategies have traditionally focused on enhancing the biosynthesis of these compounds, but promoting the development of storage structures emerges as a promising alternative to increase the content and stability of plastidial isoprenoids of interest. While the molecular mechanisms regulating chloroplast biogenesis are relatively well understood, those controlling the transformation of chloroplasts into chromoplasts or other metabolite-storing plastids remain poorly explored. This thesis aims to explore new biofortification strategies based on creating novel storage sites for carotenoids and tocopherols in plant cells, and to gain insight into the molecular mechanisms underlying plastid transitions.

To address this goal, carotenoid overproduction was artificially induced in different cellular compartments to assess whether storage structure formation is developmentally programmed or an emergent response to metabolic pressure. The results indicate that excessive carotenoid accumulation, even outside plastids, exceeds solubility limits and triggers a spontaneous reorganization of cellular architecture, leading to the formation of new membranes and lipid-rich compartments. These findings suggest that storage plastids can arise as a physicochemical consequence of metabolic overflow.

In a second approach, a chemical biology strategy was employed to induce isoprenoid-storing plastids from chloroplasts using the small molecule X57. This compound increases tocopherol content by combining biosynthetic induction, precursor redistribution, and enhanced storage capacity through plastoglobule proliferation. This conversion process is reversible and enabled a controlled analysis of plastid dedifferentiation and redifferentiation.

Finally, X57 was shown to inhibit the phosphatase SAL1, resulting in the accumulation of the retrograde signal PAP, repression of key chloroplast identity factors such as GLK1, and reduced cytokinin levels. This regulatory modulation weakens chloroplast identity and promotes plastid reorganization toward storage functions in response to metabolite accumulation. Overall, these results demonstrate that plastid differentiation emerges from the integration of metabolic pressure and regulatory permissiveness.

[CA] Els isoprenoides plastídics són una família diversa de compostos, molts dels quals exerceixen funcions clau en la fotosíntesi i la fotoprotecció. Entre ells, els carotenoides i els tocoferols són potents antioxidants que també tenen rellevància nutricional com a provitamina A i vitamina E, respectivament. Les estratègies de biofortificació s'han centrat tradicionalment en millorar la biosíntesi d'aquests compostos, però promoure el desenvolupament d'estructures d'emmagatzematge apareix com una alternativa prometedora per augmentar el contingut i l'estabilitat dels isoprenoides plastídics d'interés. Tot i que els mecanismes moleculars que regulen la biogènesi del cloroplast són relativament ben coneguts, aquells que controlen la transformació de cloroplasts en cromoplasts o altres plastidis emmagatzemadors de metabòlits han estat molt menys explorats. Aquesta tesi té com a objectiu explorar noves estratègies de biofortificació basades en la creació de nous llocs d'emmagatzematge de carotenoides i tocoferols en les cèl·lules vegetals, així com aprofundir en els mecanismes moleculars que sustenten les transicions plastídiques.

Per a abordar aquest objectiu, es va induir la sobreproducció artificial de carotenoides en diferents localitzacions cel·lulars per tal de determinar si la formació d'estructures d'emmagatzematge és un procés programat o una resposta emergent a la pressió metabòlica. Els resultats indiquen que una acumulació excessiva de carotenoides, fins i tot fora dels plastidis, supera els límits de solubilitat i provoca una reorganització espontània de l'arquitectura cel·lular, amb la formació de noves membranes i compartiments lipídics. Aquests resultats suggereixen que els plastidis emmagatzemadors poden sorgir com una conseqüència fisicoquímica de l'excés metabòlic.

En una segona aproximació, es va utilitzar un enfocament de biologia química per induir plastidis emmagatzemadors a partir de cloroplasts mitjançant la molècula X57. Aquest compost incrementa el contingut de tocoferols combinant l'activació biosintètica, la redistribució de precursors i l'augment de la capacitat d'emmagatzematge mitjançant la proliferació de plastoglòbuls. El procés és reversible i va permetre analitzar de manera controlada la desdiferenciació i rediferenciació plastídica.

Finalment, es va demostrar que X57 inhibeix la fosfatasa SAL1, provocant l'acumulació del senyal retrògrad PAP, la repressió de factors clau de la identitat del cloroplast, com GLK1, i una reducció dels nivells de citocinines. Aquesta modulació afavoreix una reorganització del plastidi cap a funcions d'emmagatzematge com a resposta a l'acumulació de metabòlits. En conjunt, els resultats mostren que la diferenciació plastídica emergeix de la integració entre pressió metabòlica i control regulador.