Desarrollo y utilización de marcadores moleculares para el genotipado de la colección de líneas de introgresión de Solanum lycopersicoides en el fondo genético del tomate cultivado

Abstract

[ES] Con objeto de ensanchar la base genética de las especies cultivadas se recurre a las especies silvestres relacionadas. Solanum lycopersicoides es la especie silvestre más alejada genéticamente del tomate cultivado (S. lycopersicum), a partir de la cual, ha sido posible obtener descendencia fértil a través del híbrido interespecífico. Se han realizado numerosos estudios que demuestran su potencial como fuente de variación en programas de mejora. Un grupo de investigadores desarrolló una colección de líneas de introgresión (ILs) de S. lycopersicoides en el fondo genético de la especie cultivada. Dada la isogenicidad entre líneas con respecto al genoma recurrente, toda la variación genética que se distingue entre ellas puede ser directamente asociada al segmento introgresado. Esta población de premejora constituye, por tanto, una herramienta muy útil para el cartografiado de genes de interés así como la incorporación rápida de dichas características en programas de mejora. Un importante porcentaje de líneas de la colección, por problemas de esterilidad, no se puede mantener en homocigosis. Para el manejo y evaluación de la colección es necesario disponer de marcadores moleculares que permitan determinar o confirmar la presencia de la introgresión en las líneas. Incrementar la densidad de los marcadores disponibles facilita, por una parte, la identificación de recombinación en los fragmentos grandes mantenidos en heterocigosis y, por otra parte, aumenta la definición en la determinación del tamaño de las introgresiones. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar marcadores de tipo CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) para permitir el manejo de la colección de ILs. Además, se pretendía utilizar los marcadores desarrollados para genotipar líneas homocigotas para la introgresión, con objeto de conocer la longitud de dicho fragmento, así como estudiar la segregación de la descendencia de líneas heterocigotas con la finalidad de reproducir la semilla disponible. Para la consecución del primer objetivo, se emplearon marcadores CAPS descritos como polimórficos entre tomate y otras especies silvestres relacionadas, fundamentalmente derivados de marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) o COS (Conserved Ortholog Set). Se realizó la amplificación mediante PCR de los parentales de la colección ILs, así como, del híbrido interespecífico entre ambos. Para la búsqueda de polimorfismo se utilizó una batería compuesta por diez endonucleasas. En 25 de los 44 marcadores probados se obtuvo producto de amplificación para S. lycopersicoides y S. lycopersicum, así como en el híbrido interespecífico. Se desarrollaron un total de 14 marcadores polimórficos, 3 de los cuales proceden de polimorfismo hallado en PCR, mientras que en los 11 restantes el polimorfismo surge tras la digestión enzimática. En el genotipado de líneas de la colección se emplearon marcadores polimórficos desarrollados en este trabajo y algunos identificados en estudios previos. Se genotiparon nueve líneas de la colección de ILs. Se estudió la longitud de la introgresión en los fragmentos mantenidos en homocigosis., En el caso de las líneas mantenidas en heterocigosis, se analizó la segregación en su descendencia. Se confirmó la distorsión de la segregación asociada a la presencia de determinadas introgresiones. En algunos casos se detectó recombinación, mientras que en otros se identificó la pérdida del fragmento. Estos resultados ponen en evidencia la importancia del incremento en la densidad de marcadores polimórficos para el manejo de la colección de ILs

[EN] Wild relatives are frequently used with the aim of widening the genetic basis of cultivated species. Solanum lycopersicoides is the most distant tomato relative that has been possible to cross with tomato to obtain fertile progeny. Several research works showed the potential of this species as a variation source in breeding programs. A group of researchers developed a collection of introgression lines (ILs) derived from S. lycopersicoides in genetic background of the cultivated species. Given the isogenicity between these lines and the recurrent genome, all the genetic variation identified between them can be directly associated to the introgressed segment. This pre-breeding population represents, therefore, a very useful tool for interesting genes mapping, as well as for the rapid incorporation of those characteristics in breeding programs. A high percentage of introgression lines cannot be maintained as homozygotes, given sterility problems. Availability of molecular markers to determine or confirm the presence of a concrete fragment is necessary for the management and evaluation of the collection. Increasing the density of available markers would facilitate, on one hand, the identification of recombination in large fragments maintained in heterozygous state and, on the other hand, increase the definition in the determination of introgression sizes. The objective of the work here presented was to developed CAPS markers (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) to allow the handling of the collection. Besides, another objective was the use of the markers developed in order to analyze homozygotes to determine the introgressions size, as well as to study segregation in progenies from heterozygotes to reproduce them. To achieve the first objective, CAPS markers previously reported as polymorphic between tomato and other wild relatives were used; these were mainly PCR-markers derived from RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism) or COS (Conserved Ortholog Set). Both parental lines and the interspecific hybrid between them were analyzed by PCR amplification. Polymorphism was searched using ten restriction enzymes. Amplification product was obtained for S. lycopersicoides, S. lycopersicum the interspecific hybrid for 25 out of the 44 markers tested. A total of 14 polymorphic markers were developed: 3 of them provided polymorphism at the PCr level, while for the other 11 restriction was necessary to reveal polymorphism. Polymorphic markers developed in this work as well as some other previously identified were used in the genotyping assay. Nine ILs were analyzed. Introgression length was studied in the homozygous ILs. In the case of heterozygous ILs, segregation in their progenies was evaluated. Segregation distortion was confirmed as associated to the presence of concrete introgressions. Recombination was detected in some cases, as well as the loss of some fragments. These results highlight the importance of increasing markers density for the management of the ILs collection.