Remodelado de la matriz extracelular en la interfase célula--¿proteína--¿material

Abstract

[ES] La respuesta celular a los sustratos sintéticos puede ser controlada a través de los fenómenos que ocurren en la interfase célula-material. Uno de los fenómenos menos estudiados es el remodelado de las proteínas de la matriz en dicha interfase. La adhesión de las células sobre los diferentes sustratos sintéticos no se produce de forma directa entre las células y los materiales, tienen que estar presentes proteínas de la matriz extracelular (ECM) como lo son fibronectina (FN), vitronectina, laminina, etc. La conformación de dichas proteínas es muy importante y va a influir en la posterior respuesta celular, ya que dependiendo de ella unos dominios u otros de estas proteínas van a quedar o no expuestos, fomentando la adhesión celular y permitiendo la interacción con los receptores celulares, como las integrinas dando lugar a la formación de complejos de adhesión focal que anclan las células a la superficie y dan lugar a la respuesta celular. De esta interacción inicial depende la respuesta celular que haya posteriormente y de ella la capacidad que tengan las células para reorganizar la capa de proteínas adsorbidas en la superficie de un material. El trabajo consistirá en comprender el remodelado de la matriz extracelular en la interfase célula-material sobre materiales de química superficial ligeramente diferente (poliacrilato de etilo y poliacrilato de metilo), los cuales dan lugar a una conformación muy diferente de la FN causando diferentes respuestas celulares iniciales. Para esto se ha estudiado la adsorción de la FN sobre los diferentes sustratos a dos concentraciones diferentes (2 y 20 ¿g/ml) a las cuales se ha visto que la distribución y conformación es también dependiente de ésta. Se cuantificó la cantidad de FN adsorbida mediante western blot (WB) y la conformación de dicha proteína haciendo uso de un anticuerpo (cuyo epítopo es uno de los dominio de unión celular) mediante ELISA. Dado que la adsorción de la FN depende mucho en la respuesta celular inicial se estudió la formación de adhesiones focales mediante inmunofluorescencia de vinculina y la señalización celular ocurrida tras esta mediante la expresión proteica de FAK (kinasa de adhesión focal) y pFAK. Como estudios más detallados, los que dependen de los ya comentados, se investigaron las diferencias en la expresión de integrina ¿5 mediante la técnica de entrecruzamiento y extracción, seguida de inmuofluorescencia, así como su expresión proteica (WB) y génica (RT-PCR), al igual que la integrina ¿v. Finalmente, se correlacionó estos resultados con la expresión génica y actividad de las metaloproteinasas de la matriz (analizadas mediante PCR y zimografía respectivamente). Todos los resultados nos hacen ver como conclusión general que la adsorción de proteínas es un proceso muy importante que va a tener implicaciones en la respuesta celular y por lo tanto en la actividad celular en cuanto a degradación de la matriz extracelular.

[EN] Matrix remodeling at the cell-material interface is an important issue to direct cell behaviour on biomaterials for regenetive medicine and tissue engineering. Cell adhesion on different synthetic substrates does not occur directly between cells and materials, but it is mediated by extracellular matrix proteins (ECM) such as fibronectin (FN), vitronectin, laminin, etc. somehow immobilized on the materials surface Conformation attained by these proteins after adsorption is of outmost importance to trigger subsequent cellular responses. So, protein conformation will define which proteins domains are available for cell adhesion, promoting the activation of cell receptors, integrins, and leading to the formation of focal adhesion complexes which anchor the cells to the material surface. Afterwards, cells tend to rearrange the adsorbed protein layer on the surface of a material, secrete new matrix and degrade it, a process called remodeling. This work includes cell remodeling of the extracellular matrix at the cell-material interface using substrates of slightly different surface chemistry (poly(ethyl acrylate) and poly(methyl acrylate)), which give rise to a very different conformation of FN causing different initial cell responses. To do so we have studied FN adsorption on different substrates at two different concentrations (2 and 20 ¿g/ml), which results in different distribution and conformation of the protein at the material interface. The amount of adsorbed FN was analysed by western blot (WB) and the conformation of the protein by ELISA using an antibody whose epitope is one of the cell-binding domain. As FN adsorption determines the initial cellular response, we have studied the formation of focal adhesions (vinculin) by immunofluorescence and subsequent cell signalling by FAK expression (focal adhesion kinase) and its phosphorylation pFAK. More detailed studies were performed to get further insights into integrin expression by using integrin crosslinking and extraction followed by immunofluorescence, as well as protein expression (WB), and gene expression (RT-PCR) for ¿5 and ¿v, to correlate cell adhesion with matrix degradation, characterized by gene expression and the activity of matrix metalloproteinases (analysed by PCR and zymography, respectively). All results conclude that protein adsorption is a very important process that will have implications in the