Caracterización molecular del determinante genético del virus del bronceado del tomate (TSWV) responsable de superar la resistencia mediada por el gen Tsw en pimiento

Abstract

[ES] El virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV) está considerado como una de las virosis más destructivas de la agricultura actual, siendo capaz de infectar a una gran variedad de cultivos hortícolas, ornamentales y especies de malas hierbas. En España, la enfermedad del bronceado provoca grandes pérdidas económicas en los cultivos de pimiento (Capsicum ssp), produciéndose la mayor incidencia en toda la zona mediterránea. El método de control más eficaz es el desarrollo de variedades con resistencia. La incorporación en cultivares de pimiento del gen Tsw, procedente de Capsicum chinense, supuso una disminución importante de las pérdidas económicas, debido a su amplio espectro de acción. Sin embargo, debido a la elevada diversidad y a la gran adaptabilidad del TSWV, han aparecido numerosos aislados que superan esa resistencia. Se ha demostrado experimentalmente que los determinantes genéticos responsables de la superación de la resistencia conferida por el gen Tsw se encuentran en el segmento S del genoma viral. Sin embargo, hasta la fecha no se ha podido determinar si la superación de la resistencia está causada por una serie de sustituciones indeterminadas en la proteína NSs o en la proteína N. Por tanto, La caracterización de los determinantes virales responsables de la rotura de la resistencia constituye el objetivo del presente trabajo final de Máster. Para ello, se pretende expresar transitoriamente en plantas de pimiento portadoras del gen Tsw las dos proteínas codificadas en el segmento S del genoma viral (Nss y N), tanto de aislados que superan la resistencia (aislados de tipo P) como de los que no la superan (aislados de tipo N), para determinar cuál de ellas es capaz de desencadenar la respuesta hipersensible. Como resultado de este trabajo se han conseguido clonar los genes que codifican las proteínas NSs y N de diferentes aislados de TSWV en el vector de expresión pMOG 800. La agroinfiltración de los clones recombinantes, con la cepa C58C1 de A. tumefaciens, en la planta modelo N. benthamiana confirmó la eficacia del ensayo ya que las hojas agroinfiltradas no desarrollaron ningún tipo de síntomas y la expresión de las proteínas NSs y N fue verificada mediante análisis western. Sin embargo, los mismos experimentos realizados en plantas de pimiento no fueron satisfactorios debido a la necrosis que provoca la propia bacteria en las hojas agroinfiltradas. Será necesario realizar nuevos ensayos de agroinfiltración empleando una cepa diferente de A. tumefaciens (cepa 1D1249), con el propósito de determinar la proteína y los aminoácidos responsables de la rotura de la resistencia.

[EN] Tomato spotted wilt virus (TSWV) is one of the most destructive viruses in the current agriculture, being able to infect a wide range of horticultural and ornamental crops and weed species. In Spain, the spotted wilt disease causes severe economic losses in pepper (Capsicum ssp.), with a bigger impact in the whole Mediterranean area. The most effective control method consists of developing varieties with resistance genes. The incorporation of Tsw gene from Capsicum chinense in pepper cultivars has been the most successful choice due to their large range of action. Because of that, they have been applied since 1996 to a big number of commercial varieties, which has lead to a significant reduction of economic losses. However, because of the high diversity and adaptability of the TSWV, several isolates that overcome such resistance have appeared. Some experiments have shown that genetic determinants responisbles of overcoming the resistance conferred by Tsw gene is in S segment of the viral genome. However, to date has not been determined whether overcoming resistance is caused by an indeterminate number of substitutions in the protein or protein NSs N. Therefore, characterization of the viral determinants responsible for the breaking resistance is the aim of this Master Thesis. For to this, it is necessary transiently express in pepper plants carry the Tsw gene two proteins encoded in the S segment of the viral genome (NSs and N) from resistance-breaking isolates (isolates P-type) and resistance-inducing isolates (isolates N-type), to determinate which of them is able to trigger the hypersensitive response As a result of this Thesis,we have succeeded in cloning genes encoding the NSs and N protein from different isolates of TSWV in pMOG 800 expression vector. The agroninfiltration of the recombinant clones with A. tumefaciens C58C1 strain, in the model plant N.benthamiana confirmed the efficacy of the trial as agroninfiltrate leaves didn't developed symptoms and expression of NSs and N protein was verified by Western analysis. However, these experiments in pepper plants were unsuccessful due to the necrosis caused by the bacteria itself in agroinfiltrated leaves. It will be necessary to conduct new tests agroinfiltration using a different strain of A. tumefaciens (strain 1D1249), with the aim of determining the protein and the aminoacids responsible for the breakage resistance.