Generation of a Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium Clinical Isolate Expressing a (FMN)-Based Fluorescent Protein

Abstract

[EN] Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacteria, including Vancomycin-Resistant Enterococcus (VRE), have become one of the greatest clinical challenges of the 21st century. Particularly, VRE strains of E. faecium, a natural member of the gastrointestinal consortia, have recently emerged as one of the most problematic cases of MDR nosocomial pathogens. It is widely known that the establishment of high-level intestinal colonization of this bacterium, triggered by antibiotic treatment of the host, potentially leads to bacteremia, endocarditis and surgical wound, urinary tract, and device-related infections in hospitalized patients. However, the unique determinants possessed by these strains, which enable them to benefit from the antibiotic-induced perturbations of the gut microbiota and host intestinal immune defenses, remain to be identified. Essentially, what needs to be revealed is the differential gene expression of E. faecium in its niche at different time points; before and during antibiotic treatment of the host, and very interestingly, in the presence of probiotic bacteria. Differentially expressed genes will highlight how and why E. faecium is able to dominate the gut, as well as how it interacts with its surroundings, possibly pinpointing its potential weaknesses, as well as provide hints on what specific properties should be prerequisites for bacteria to be used as probiotics. Since the global expression intended to be analyzed is that of E. faecium alone, a method to separate this bacteria from the rest of the gut microbiota is required. Failure to do so would result in the study of the gut microbiota’s transcriptome as a whole: metatranscriptomics. In practice, the separation VRE. faecium from the rest of the commensal microbiota could be carried out by means of flow cytometry if the generation of a fluorescent E. faecium was achieved. Additionally, it would serve as a great tool to study a series of facets of VRE faecium colonization which remain virtually unknown. It would enable the monitorization of VRE infection through whole-body imaging of infected mice, fluorescence microscopy analysis of histological cuts to determine its most predominant locations, the use of FbFP as a translational or transcriptional reporter, etc. Consequently, the main objective of this Final Degree Project has been to attempt the generation of a Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium clinical isolate (C68) expressing a fluorescent protein whose chromophore can form under the anaerobic conditions found in the guts of animals: (FMN)-based fluorescent protein (FbFP). In order to fulfill the main objective of this work, first, the FbFP gene was synthesized with the appropriate features for its expression in E. faecium and for its cloning. Next, the plasmid construction aimed to confer E. faecium fluorescent properties (pBT2-FbFP), was generated. This was done by inserting the FbFP gene into the pBT2 plasmid. As a previous step to the transformation of E. faecium, pBT2-FbFP was transformed into E.coli DH5a in order more efficiently validate the integrity of the plasmid construction. After validation, E faecium was finally transformed and the corresponding fluorescence analyses were performed.

[ES] Las infecciones causadas por bacterias resistentes a múltiples fármacos (MDR), incluyendo el Enterococo resistente a la vancomicina (VRE), se han convertido en uno de los mayores retos clínicos del siglo 21. En particular, las cepas de E. faecium, miembro natural de la microbiota gastrointestinal, suponen actualmente uno de los casos más problemáticos de MDR patógenos nosocomiales. La colonización intestinal con altos niveles de esta bacteria es provocada por el tratamiento con antibióticos y puede producir bacteriemia, endocarditis, infecciones del tracto urinario y de heridas quirúrgicas o relacionadas con dispositivos médicos, en pacientes hospitalizados. Sin embargo, aún no se han identificado los determinantes específicos que les permiten a estas cepas beneficiarse de las alteraciones inducidas por los antibióticos sobre la microbiota y las defensas del sistema inmune intestinal. En esencia, se necesita conocer la expresión diferencial de los genes de E. faecium en su nicho y en diferentes momentos: antes y durante el tratamiento con antibióticos, así como en presencia de bacterias probióticas. Los genes expresados diferencialmente pondrían de relieve cómo y por qué E. faecium es capaz de dominar el intestino o la forma en que interactúa con su entorno, posibilitando la localización de sus debilidades potenciales y mostrando qué propiedades específicas deberían ser requisitos previos de una bacteria para ser utilizada como probiótico. Dado que la expresión global a analizar es la de E. faecium solo, se necesita un método para separar esta bacteria del resto de la microbiota intestinal. No hacerlo, daría lugar al estudio del transcriptoma de la microbiota intestinal en su conjunto: metatranscriptómica. En la práctica, la separación de VRE faecium del resto de la microbiota comensal podría llevarse a cabo por medio de citometría de flujo una vez lograda la generación de un E. faecium fluorescente. Además, constituiría una gran herramienta para el estudio de una serie de facetas de la colonización de VRE faecium que siguen siendo prácticamente desconocidas. Por ejemplo, permitiría la monitorización de la infección por VRE a través de imágenes del cuerpo de ratones infectados, el análisis de microscopía de fluorescencia de cortes histológicos para determinar sus principales localizaciones, el uso de FbFP tanto como reportero transcripcional como de traducción, etc. Por ello, el objetivo principal de este Trabajo de Fin de Grado la generación de un aislado clínico (C68) vancomicina resistente de Enterococcus faecium a través de la expresión de una proteína fluorescente cuyo cromóforo pueda formarse en las condiciones anaerobias de los intestinos de los animales: proteína fluorescente basada en FMN (FbFP). Con el fin de cumplir con el objetivo principal de este trabajo, el gen FbFP fue sintetizado con las características apropiadas para su expresión en E. faecium así como para su clonación. A continuación, se generó la construcción del plásmido destinado a conferir propiedades fluorescentes a E. faecium (pBT2-FbFP). Esto se hizo mediante la inserción del gen FbFP en el plásmido pBT2. Como paso previo a la transformación de E. faecium, pBT2-FbFP se transformó en E. coli DH5a con el fin de validar de manera más eficiente la integridad de la construcción del plásmido. Después de su validación, E. faecium fue transformado y se realizaron los correspondientes análisis de fluorescencia.