Análisis de determinantes de localización subcelular en el supresor del silenciamiento por RNA codificado por el virus del arabesco del Pelargonium

Abstract

[ES] En plantas, el silenciamiento por RNA constituye un potente mecanismo de defensa antiviral. Este mecanismo es activado por RNAs virales de doble cadena, producidos en el curso de la infección, que son reconocidos por RNasas III de tipo Dicer, cuya acción genera pequeños RNAs (small RNAs, sRNAs) de entre 20 y 24 nt. A continuación, una de las cadenas de esos sRNAs es incorporada a un complejo multiproteico conocido como RISC (RNA-induced silencing complex), cuyo componente principal es una endonucleasa de la familia de las Argonautas. Una vez activado, RISC es dirigido por el sRNA asociado hasta RNAs de secuencia complementaria provocando su degradación. Con el fin de evadir este mecanismo de defensa, los virus codifican proteínas conocidas como supresores del silenciamiento por RNA (viral RNA silencing suppressors, VSRs). Los VSRs son muy diversos en cuanto a tamaño y secuencia, y las bases moleculares de su actividad no se conocen con precisión en la gran mayoría de los casos. Este trabajo se ha centrado en el estudio del VSR codificado por el virus del arabesco del Pelargonium (Pelargonium line pattern virus, PLPV), un miembro de la familia Tombusviridae que causa infecciones frecuentes en geranio. Experimentos anteriores habían permitido identificar a la proteína de cubierta viral (CP o p37) como el VSR del PLPV y habían mostrado que p37 se localiza en el citoplasma, núcleo y nucleolo de células vegetales. Como ocurre con otras proteínas, el examen de la localización subcelular de los VSRs puede aportar datos significativos acerca de su modo de acción, de modo que nos propusimos investigar posibles motivos/regiones de p37 involucrados en su distribución intracelular. Como en otras CPs de especies de la familia Tombusviridae, en la proteína p37 del PLPV se pueden predecir tres dominios estructurales, denominados R, S y P. Un análisis in silico de p37 no reveló la presencia de señales de localización nuclear o nucleolar canónicas en la molécula aunque sí que permitió el reconocimiento de una posible señal de exportación nuclear (nuclear export signal, NES) en el dominio S. Mediante ensayos de expresión transitoria de fusiones de los distintos dominios con la proteína verde fluorescente (green fluorescent protein, GFP) y observación al microscopio confocal, se ha podido determinar que el dominio R es el responsable de la localización nucleolar de p37. Además, la modificación de la NES potencial mediante mutagénesis dirigida y el análisis de la distribución subcelular de la correspondiente proteína mutada (fusionada a GFP) han puesto de manifiesto que la NES predicha no es funcional in vivo ya que su alteración no provoca cambios en el patrón de distribución de p37. Sin embargo, ensayos de supresión han mostrado que la modificación de la putativa NES da lugar a una pérdida de la capacidad de p37 para inhibir el silenciamiento, lo que indica que el dominio S contribuye a la función como VSR de este producto viral. El bioensayo de un PLPV mutante con la putativa NES alterada ha permitido corroborar que la actividad VSR es indispensable para que el virus pueda multiplicarse de forma efectiva en plantas, subrayando la necesidad del patógeno de contrarrestar los mecanismos de defensa del huésped para asegurar su supervivencia.

[EN] In plants, RNA silencing acts as a potent antiviral defense mechanism. This type of mechanism is triggered by viral-derived double-stranded RNAs produced during the infection, which are recognized by Dicer-like RNase III-related enzymes, whose action produce small RNAs (sRNAs) of 20-24 nt. Then, one strand of sRNA is incorporated into a multiprotein complex known as RISC (RNA-induced silencing complex), whose core component is an endonuclease protein from the Argonaute family. Once RISC is activated, the sRNA strand acts as guide to bring the RISC complex into contact with complementary RNAs, thereby causing their degradation. To counteract this host defense mechanism, viruses encode suppressors of RNA silencing (VSR). The VSRs are very diverse in size and sequence, and the molecular bases of their activity are not well known in most cases. This work has focused on the study of the VSR encoded by Pelargonium line pattern virus (PLPV), a member of the family Tombusviridae that causes frequent infections in geranium. Previous experiments have allowed the identification of the coat protein (CP or p37) as the VSR of PLPV, and have also shown that p37 localizes in the cytoplasm, nucleus and nucleolus of plant cells. As for other proteins, the study of the subcellular localization of VSRs can provide valuable information about its mode of action, we decided to investigate possible motifs or regions of p37 involved in its subcellular distribution. As in other CPs encoded by species of the Tombusviridae family, three structural domains can be predicted in PLPV p37, called R, S and P. An in silico analysis of p37 did not reveal the presence of canonical nuclear or nucleolar localization signals in the molecule although it did recognize the presence of a potential nuclear export signal (NES) in the S domain. Transient expression assays with the different domains fused to the green fluorescet protein (GFP) and subsequent observations with confocal microscope have revealed that the R domain is the responsible of the nucleolar localization of p37. Furthermore, modification of the potential NES, using site-directed mutagenesis, and analysis of the subcellular distribution of the corresponding mutant protein (fused to GFP) have shown that the putative NES is not functional in vivo because its modification does not change the subcellular distribution of p37. However, suppression assays have shown that the alteration of the putative NES results in a loss of the ability of p37 to inhibit RNA silencing, supporting that the S domain contributes to the VSR function of p37. The bioassay of a mutant PLPV with modifications in the putative NES has corroborated that the VSR activity is required for effective viral multiplication in plants, stressing the need of the pathogen to counteract the host defense mechanism to ensure its survival.