Optimización de la detección de daños oxidativos en la célula viva y en tiempo real

Abstract

[EN] Yeast (Saccharomyces cerevisiae) is an important model to understand the molecular mechanisms of the defense to different types of stress. Production of reactive oxygen species (ROS) is one of the fundamental stresses for all cells. The increase of ROS can be produced by external agents (like H2O2 and menadione) or by the cell itself (for example, during cellular respiration). In these situations of stress, yeast cells modify their transcriptional capacity to adapt to environmental conditions and survive. This adaptation occurs via stress-induced activation of transcription factors, which recognize and bind specific regulatory sites in cis and facilitate the access of the transcriptional pre-initiation complex to the promoters. To study how specific transcription factors contribute to the transcriptional response profile, a system is needed to quantify the modulation of gene expression by stress in real time and in living cells. Thus, in the present work a destabilized luciferase system (lucCP+) is used as a tool to detect and quantify oxidative damage produced by various treatments in yeast. Specifically we apply two types of reporters with the gene lucCP+ whose expression is regulated by the two key transcription factors that act in response to oxidative stress: Yap1 and Skn7. Subsequently, the dose dependent responses obtained for the two reporters are compared in a quantitative manner in various conditions of external stress (H2O2; menadione) and the sensitivity is determined for both reporters. On the other hand, the destabilized luciferase system is also used to study the dynamic transcriptional response to salt and osmotic stress of the GRE2 and SOD2 promoters in different culture media. Specifically, the way the fermentative or respiratory metabolism influence in the transcriptional response to diverse saline and oxidative stresses has been investigated. Therefore, growth media with glucose (fully fermentative medium) or galactose (partially respiratory medium) as an energy source were used to quantify the differences in the dynamic dose response to stress with various stress-responsive luciferase reporters. These assays have been supplemented with growth assays in liquid medium, which allows evaluating the sensitivity of yeast cells to salt stress comparing glucose and galactose medium. As a result it was confirmed that galactose growth renders the transcriptional response to salt stress more sensitive (faster saturation of the response at lower salt concentrations), and that yeast growth is more efficiently inhibited by salt stress in galactose medium. Finally, the glycerol production upon salt stress was compared in yeast cells grown in glucose or galactose. Glycerol is one of the most important osmolytes in the osmoadaptation process of yeast cells. It was confirmed that yeast cells grown on galactose medium produce significantly less amounts of glycerol as compared to glucose medium.

[ES] La levadura Saccharomyces cerevisiae es un modelo muy importante para comprender los mecanismos moleculares de la defensa a diferentes tipos de estrés. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) es uno de los estreses fundamentales para todas las células. El aumento de ROS puede producirse por agentes externos (como H2O2, menadiona) o por la propia célula (por ejemplo, durante la respiración). Ante estas situaciones de estrés, las células de levadura modifican su capacidad transcripcional para adaptarse a las condiciones ambientales y sobrevivir. Esta adaptación, se produce gracias al reconocimiento del estrés por parte de los factores de transcripción, encargados de generar una respuesta transcripcional mediante el reconocimiento y la unión específica a sitios reguladores en cis y el favorecimiento del acceso del complejo de pre-iniciación de la transcripción a los promotores. Para poder estudiar como factores de transcripción específicos contribuyen al perfil de respuesta transcripcional es necesario un sistema que permita cuantificar la modulación de la expresión génica por estrés en tiempo real y en células vivas. Para ello, en el presente trabajo se emplea un sistema de luciferasa desestabilizada (lucCP+) como herramienta para detectar y cuantificar los daños oxidativos producidos por varios tratamientos en levadura. Para ello, se aplican dos tipos de reporteros con el gen lucCP+ cuya expresión está regulada por los dos principales factores de transcripción que actúan en respuesta a estrés oxidativo: Yap1 y Skn7. Posteriormente, se compara de forma cuantitativa las respuestas dependiendo de la dosis de los dos reporteros en varias condiciones de estrés oxidativo externo (H2O2; menadiona), así como también se determinan las sensibilidades de ambos reporteros a los distintos tipos de oxidación intracelular. Por otro lado, también se emplea el sistema luciferasa desestabilizada para estudiar la dinámica transcripcional en respuesta a estrés salino y osmótico de los promotores GRE2 y SOD2 en diferentes medios de cultivo. Es decir, se ha investigado sobre la manera en la que el metabolismo fermentativo y respiratorio influyen en la respuesta a nivel transcripcional a diversos estreses tanto salino como oxidativo. Para ello, se han empleado medios que emplean glucosa como fuente de energía (medio completamente fermentativo) y medios que emplean galactosa como fuente de energía (medio parcialmente respiratorio).Estos ensayos se han complementado con un ensayo de crecimiento en medio líquido, que permite evaluar la sensibilidad de las células de levadura a medio con glucosa y con galactosa. Como resultado de estos ensayos se confirmó que cuando las células crecen en medio con galactosa responden a estrés salino de forma mucho más sensible (la saturación de la respuesta es más rápida a bajas concentraciones de sal), también se pudo deducir que el crecimiento es inhibido de forma más eficiente cuando las células se someten a estrés en medio con galactosa. Por último, se midió la producción de glicerol, osmolito que juega un papel importante en la osmoadaptación, comparándose los resultados de la producción en medio con glucosa con la producción en medio con galactosa. Se confirmó que cuando las células de levadura crecen en medio con galactosa la cantidad de glicerol producida es significativamente menor en comparación con el medio de glucosa.