Characterization of AtMC1, network and catalytic requirements

Abstract

[EN] Metacaspases (MC), cysteine-dependent proteases, are important for several plant activities inducing Programmed Cell Death (PCD). Arabidopsis thaliana metacaspase 1 (AtMC1) is a positive regulator of cell death inducible by pathogen. This project has been focused in the analysis of the protein network and catalytic requirements of this protein. Mutant lsd1atmc1 plants transformed with a mutated AtMC1 (PAtMC1::AtMC1-HA: Q40A, S162A and D218A) were successful developed. The Q40A mutation affected AtMC1 protein activity and it may act as a gatekeeper of the metacaspase substrate binding site. The mutations S162A and D218A did not affect AtMC1 activity. The expression of AtMC1-D102A has been studied in Nicotiana benthamiana, as a previous step before Arabidopsis transformation. The constructions pENTR/D-TOPO-PAtMC1::AtMC1-C99A-HA, pENTR/D-TOPO-PAtMC3::AtMC3-G183E-HA and pENTR/D-TOPO- PAtMC3::AtMC3-G183E-HA were obtained. The first one to further analyse the substrate recognition of AtMC1 and the two last in order to reproduce and analyse the phenotype of the atmc3 G183E tilling mutant that is not complemented with AtMC3, a metacaspase with unknown function. AtMC1 and the putatively active AtMC1-ΔN (more soluble) were produced in Escherichia coli BL21 cells. The best extraction conditions analysed involved protein extraction at 24ºC during 6 hours. This protocol will be useful to study substrate affinity and interactions. The role of putative interactors AtMC4 and AtSerpin1 have been analysed. Initial data involving transient expression in N. benthamiana do not support a clear regulative interaction. Nevertheless, double mutants (atmc1atmc4, atmc1atserpin1 and atserpin1lsd1) in Arabidopsis have been obtained to clarify these results. Triple mutants have been generated to study the interaction of AtMC1, atg18a (involved in autophagy) and AtRbohD (involved in pathogen-triggered ROS defense responses). The relationship of AtMC1 and NBR1 (involved in selective autophagy) has also been studied, suggesting an indirect homeostatic defect in the atmc1 mutant with consequences in selective autophagy.

[ES] Metacaspasas (MC), proteasas dependientes de cisteína, son importantes para diversas actividades de las plantas, induciendo la Muerte Celular Programada (PCD). La metacaspasa 1 de Arabidopsis thaliana (AtMC1) es un regulador positivo de la muerte celular inducida por patógenos. Este proyecto se centra en el análisis de la framework regulatoria de AtMC1 y sus requerimientos catalíticos. Mutantes lsd1atmc1 transformados con AtMC1 mutado (PAtMC1::AtMC1-HA: Q40A, S162A y D218A) se desarrollaron con éxito. La mutación Q40 afecta a la actividad de la proteína y puede actuar como guardián del sitio de unión del substrato. Las mutaciones S162 y D218 no afectan a la actividad de AtMC1. La expresión de AtMC1-D102A se ha estudiado en Nicotiana benthamiana como paso previo a la transformación en Arabidopsis Se obtuvieron las construcciones pENTR/D-TOPO-PAtMC1::AtMC1-C99A-HA, pENTR/D-TOPO-PAtMC3::AtMC3-G183E-HA y pENTR/D-TOPO- PAtMC3::AtMC3-G183E-HA. El primero para el análisis de reconocimiento del sustrato en AtMC1 y los dos últimos para reproducir y analizar el fenotipo del mutante tilling atmc3 G183E que no se complementó con AtMC3, una metacaspasa que aún no se saber su función. AtMC1 y el supuesto activado AtMC1-ΔN (más soluble) fueron producidos en Escherichia coli BL21. Las mejores condiciones de extracción analizadas fueron con la extracción de proteína a 24OC durante 6h. Se analizaron el papel de supuestos interactores AtMC4 y AtSerpin1. Los datos de expresión transitoria en N. benthamiana no soporta una clara interacción reguladora. Aun así, dobles mutantes (atmc1atmc4, atmc1atserpin1 y atserpin1lsd1) en Arabidopsis se han obtenido para clarificar los resultados. Triple mutantes se ha generado para estudiar la interacción entre AtMC1, atg18a (involucrado con autofagia) y AtRbohD (involucrado con producción de ROS inducido por patógeno). También, se ha estudiado la relación entre AtMC1 y NBR1 (involucrado en autofagia selectiva) sugiriendo efecto homeostático indirecto en los mutantes atmc1 a consecuencia de la autofagia selectiva.