Nanodispositivos dirigidos a la detección de patógenos

Abstract

[EN] Currently, nanodevice development as platforms for the transport and release of chemical molecules has become one of the most innovative applications. A key issue in this field is the design of new “smart” systems based on nanoscale structures and a variety of biomolecules, which perform unprecedented functions. Nanoscale devices can be used to develop biosensors or to deliver molecules to specific targets. In drug delivery, the development of stimuli-responsive systems has attracted tremendous attention. In particular, the use of mesoporous silica nanoparticles (MSN) has a lot of advantages due to its properties such as high biocompatibility, chemical inertness, thermal stability, and homogeneous porosity. Because of these characteristics, MSN have become appropriate tools for spatio-temporal release of chemical molecules. Additionally, mesoporous silica nanoparticles, such as type MCM-41 (Mobile Crystalline Material- 41), function as a support that serves as a reservoir in which certain compounds can be stored. Besides, some molecules or molecularly appended objects can be attached on the surface of these containers, thus acting as molecular gates. Among molecular gates, the nucleic acids have been recognized as interesting materials because of their three-dimensional conformation, specificity, double stranded coupling and robust physicalchemical structure. In this work, as a proof of principle, we designed a sensitive nanodevice for direct and rapid detection of Mycoplasma. Therefore, MSN have been selected as the inorganic support. The nanoparticles were loaded with a suitable dye (rhodamine B), and then the external surface was functionalized with isocyanates. Two complementary sequences of DNA with different lengths act as molecular gates in this system. These sequences are highly conserved in the Mycoplasma genome. The smaller DNA strand (O1) has a modification at 5 ' extreme (NH2). Through this modification, the DNA can be coupled covalently to the solid sufrase due to the reaction with the isocyanates. The second strand of DNA (O2) has two functions. First, it will be responsible for blocking the pores of the nanoparticle, but it also for mediating supramolecular interactions. These interactions will be necessary for the subsequent dye release. Consequently, dye release will depend on the presence of genomic DNA of Mycoplasma in the analyte; in which case, genomic DNA will hybridize with oligonucleotide (O2) immobilized on the nanodevice allowing for the dye release. In order to evaluate the effectiveness of this system, the MCM-41 was chemically characterized and probed through different assays. From the results, the limit of detection was calculated from approximately 70 copies of Mycoplasma uL-1. Afterwards, we found that the nanodevice was able to recognize samples selectively contaminated with Mycoplasma, even if there are other microorganisms like Candida albicans or Legionella pneumophila in the analyte. Finally, this system was tested with clinical samples previously analyzed using polymerase chain reaction (PCR). This experience confirms that our device can accurately identify the presence of Mycoplasma, in particular, Mycoplasma pneumonia, with fluorescence spectroscopy. All these results suggest that this technology is fast and efficient tool for diagnostic sensing of bacterial DNA.

[ES] El desarrollo de nanodispositivos como plataformas de transporte y liberación de moléculas químicas se ha convertido en una de las más innovadoras aplicaciones descritas durante los últimos años. Una característica fundamental de estos nanodispositivos consiste en que son capaces de liberar compuestos de interés únicamente bajo estímulos específicos lo cual, ha resultado especialmente útil para la investigación farmacológica. Dentro de este área, los nanodispositivos pueden ser utilizados a manera de biosensores o como transportadores de moléculas hacia dianas específicas. Entre los mencionados sistemas, las nasnopartículas mesoporosas de sílice (MSN) como vehículos multifuncionales constituyen un espacio de creciente interés, principalmente, porque estas matrices nanoscópicas tienen propiedades diferenciales como su elevada biocompatibilidad, inercia química, estabilidad térmica y porosidad homogénea. Debido a estas características las MSN se han convertido en herramientas apropiadas para la liberación espacio-temporal controlada de moléculas de interés químico. Dentro de los materiales mesoporosos de sílice, la MCM-41 (“Mobile Crystalline Material-41”), resulta apropiada para la fabricación de dispositivos nanoscópicos, ya que al hacer reaccionar los hidroxilos expuestos en el exterior de estas nanopartículas, resulta relativamente sencillo funcionalizar la matriz inorgánica dando lugar al acoplamiento de las denominadas puertas moleculares. Estas puertas, confieren selectividad a los soportes sólidos, ya que son capaces de abrirse y liberar el contenido de sus poros únicamente ante estímulos controlables como cambios de pH, temperatura, potencial redox, presencia/ausencia de proteínas, iones o ácidos nucleicos. Entre todas las puertas nanoscópicas moleculares, los ácidos nucleicos han sido reconocidos como compuestos interesantes debido a su conformación tridimensional, a su especificidad a la hora del acoplamiento en doble hebra y a su robusta estructura físico-química. En este sentido, el trabajo que nos ocupa, consiste en el diseño, elaboración y estudio de la funcionalidad de un sólido mesoporoso nanoparticulado de tipo MCM-41, cargado con un colorante (rodamina B), funcionalizado con isocianatos y tapizado con una puerta molecular de ADN. Este dispositivo tiene como objetivo de detectar patógenos bacterianos de tipo Mycoplasma. Para lograr la selectividad del sistema, la puerta molecular del nanodispositivo estará formada por dos hebras de ADN de diferentes longitudes (15 y 39 nucleótidos respectivamente) correspondientes a un fragmento altamente conservado de la región ribosomal 16S perteneciente a las bacterias del género Mycoplasma. La hebra pequeña (O1), presentará una modificación sintética (NH2) en su extremo 5´ la cual será acoplada covalentemente a la superficie del sólido al reaccionar con los grupos isocianato. La segunda hebra de ADN (O2), cumple una doble función. Primeramente, se encargará de bloquear la salida de la carga al cubrir los poros de la nanopartícula pero además, estará encargada de mediar las interacciones supramoleculares necesarias para la posterior liberación selectiva del colorante. La apertura de la puerta molecular dependerá de la presencia de ADN genómico de Mycoplasma en el analito, en cuyo caso la liberación del contenido de los poros, será la consecuencia de hibridación de las bases complementarias de la hebra del ADN genómico presente en el analito con el oligonucleótido (O2) inmovilizado en el nanodispositivo. Para evaluar la fiabilidad del sistema se caracterizó la matriz mesoporosa y se realizaron pruebas de efectividad. A partir de los resultados obtenidos se puede decir, que el límite de detección del nanodispositivo es de aproximadamente 70 copias de ADN de Mycoplasma uL-1. Además, el sistema diseñado es capaz de detectar de manera selectiva la presencia de ADN del género Mycoplasma incluso en presencia de ADN interferente (Candida albicans y Legionella pneumophila). Finalmente, este diseño fue testado con muestras clínicas previamente analizadas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los análisis mostraron, que el soporte sólido diseñado identifica de manera selectiva la presencia de micoplasmas en suspensión. En conjunto, estos resultados indican que la nanoformulación desarrollada es un biosensor rápido y eficiente, capaz de detectar ADN bacteriano (Mycoplasma) de manera específica y emitir una señal cuantificable mediante espectroscopia de fluorescencia, lo que lo convierte en una potencial herramienta diagnóstica.