Producción heteróloga de monoterpenos en Saccharomyces cerevisiae: selección y mejora de cepas mediante técnicas de ingeniería metabólica

Abstract

[EN] Monoterpenes (C10) are isoprenoids usually employed as aromatic additives, are important components of wine aroma and some of them have antimicrobial and health beneficial properties. An efficient microbial production of these metabolites could be an inexpensive and environmentally friendly alternative to current techniques: chemical synthesis or extraction from natural sources. They are usually produced in plants from geranyl pyrophosphate (GPP), a common intermediate of isoprenoid pathway in microorganisms and higher organisms; what opens the possibility of producing them in yeasts as Saccharomyces cerevisiae, qualified as GRAS, and that has been widely employed for biotransformation and production of enzymes and metabolites of biotechnological interest. In this work, the inherent ability of this yeast for heterologous production of monoterpenes (linalool, geraniol, etc.) capable to improve organoleptic and/or functional properties of certain foods either being used as additives or produced during the elaboration process (e.g. vinification) has been characterized and improved by metabolic engineering approaches. Among the most relevant results we can find the selection of wine strain T73 because of its better ability to produce monoterpenes, and the improvement of this production by overexpressing a deregulated version of Hmg1p (catalyzes mevalonic acid synthesis, MVA) and IDI1 (encodes isopenthenyl pyrophosphate isomerase, that catalyzes the isomerization of farnesyl pyrophosphate synthase -FPPS- substrates). In addition, characterization of the FPPS role in GPP availability for the Clarkia breweri linalool synthase resulted in a 50 times increased production in yeast strains with wild-type enzyme (encoded by ERG20) replaced by one modified in its active site (K197E), encoded by erg20-2 allele; reaching a global improvement of 80 times the basal linalool production (14.51 ± 0.90 µg/L) when coexpressing IDI1 gene and erg20-2 allele in linalool producing strains lacking endogenous FPPS activity (1144.68 ± 139.39 µg/L). Geraniol producing strains (bearing Ocimum basilicum -sweet basil- GES gene that encodes geraniol synthase) derived from T73 were included in microvinification assays and geraniol concentration was over its perception threshold and a metabolic dispersion to other monoterpene (linalool, nerol and citronellol) and aromatic esters (geranyl and citronellyl acetate) was also detected. Increased monoterpene production established in IDI1 overexpressing strains under laboratory conditions was reproduced in these assays, demonstrating that the modification of key steps of MVA pathway is a valid strategy to modulate and/or improve wine aroma.

[ES] Los monoterpenos (C10) son isoprenoides habitualmente utilizados como aditivos aromáticos, son componentes importantes del aroma de los vinos y algunos tienen propiedades antimicrobianas y/o beneficiosas para la salud. La producción eficiente de estos metabolitos en microorganismos podría ser una alternativa más económica y respetuosa con el medio ambiente que las técnicas empleadas en la actualidad: síntesis química y/o extracción de fuentes naturales. En las plantas los monoterpenos son producidos por monoterpeno sintasas que utilizan como sustrato geranil pirofosfato (GPP), siendo éste un intermediario común de la ruta de isoprenoides en microorganismos y organismos superiores, lo que abre la posibilidad de producirlos en la levadura Saccharomyces cerevisiae, que tiene el calificativo GRAS, y que ha sido además ampliamente utilizada para la biotransformación y producción de enzimas y metabolitos de interés biotecnológico. En este trabajo se ha caracterizado y mejorado, mediante técnicas de ingeniería metabólica, la capacidad inherente que tiene esta levadura para la producción heteróloga de monoterpenos (linalol, geraniol, etc.), que puedan mejorar las características organolépticas y/o funcionales de ciertos alimentos al ser usados como aditivos o al aumentar su concentración durante el propio proceso de elaboración (p. ej. vinificación). Entre los resultados más destacados están la selección de la cepa vínica industrial T73 por su mayor capacidad para producir monoterpenos, y la mejora de dicha producción mediante la sobreexpresión desregulada de la enzima Hmg1p (cataliza la formación del ácido mevalónico, MVA) y del gen IDI1 (codifica isopentenil pirofosfato isomerasa, que cataliza la isomerización de los sustratos de la farnesil pirofosfato sintasa, FPPS). Además, la caracterización del rol de la enzima FPPS en la disponibilidad de GPP para su aprovechamiento por la enzima linalol sintasa de Clarkia breweri, derivó en una producción de linalol 50 veces mayor en cepas en las que una versión modificada en su centro activo (K197E), codificada por el alelo erg20-2, reemplazaba a la enzima silvestre (codificada por ERG20); alcanzándose una mejora global de 80 veces respecto a la producción de linalol inicial (14,51 ± 0,90 µg/L), al sobreexpresar conjuntamente el gen IDI1 y el alelo erg20-2 en cepas productoras de linalol que carecen de la función FPPS endógena (1144,68 ± 139,39 µg/L). Las cepas productoras de geraniol (expresan el gen GES que en Ocimum basilicum -albahaca- codifica geraniol sintasa) derivadas de T73 se incluyeron en ensayos de microvinificación y la concentración de este monoterpeno en el vino final no sólo estuvo por encima de su umbral de percepción, sino que se produjo una dispersión metabólica del geraniol hacia otros monoterpenos (linalol, nerol y citronelol) y esteres (geranil y citronelil acetato) aromáticos. Además, el incremento de la producción de monoterpenos observado en condiciones de laboratorio en cepas que sobreexpresan el gen IDI1 se reprodujo en estos ensayos, demostrando que la modificación de pasos clave de la ruta MVA es una estrategia válida para modular y/o mejorar el aroma del vino.

[CA] Els monoterpens (C10) són isoprenoids habitualment utilitzats com additius aromàtics, són components importants de l'aroma dels vins i alguns tenen propietats antimicrobianes i/o beneficioses per a la salut. La producció eficient d'aquests metabòlits en microorganismes podria ser una alternativa més econòmica i respectuosa amb el medi ambient que les tècniques emprades en l'actualitat: síntesi química i/o extracció de fonts naturals. A les plantes els monoterpens són produïts per monoterpeno sintases que utilitzen com a substrat geranil pirofosfat (GPP), sent aquest un intermediari comú de la ruta dels isoprenoids en microorganismes i organismes superiors, el que obri la possibilitat de produir-los en el llevat Saccharomyces cerevisiae, amb qualificatiu GRAS, i que ha sigut a més àmpliament utilitzat per a la biotransformació i producció d'enzims i metabòlits d'interès biotecnològic. En aquest treball s'ha caracteritzat i millorat, mitjançant tècniques d'enginyeria metabòlica, la capacitat inherent que té aquest llevat per a la producció heteròloga de monoterpens (linalol, geraniol, etc.), que puguen millorar les característiques organolèptiques i/o funcionals de certs aliments en ser usats com additius o en augmentar la seua concentració durant el propi procés d'elaboració (p. ex. vinificació). Entre els resultats més destacats es troben la selecció de la soca vínica industrial T73 per la seua major capacitat per a produir monoterpens, i la millora d'aquesta producció mitjançant la sobreexpressió desregulada de l'enzim Hmg1p (catalitza la formació de l¿àcid mevalònic, MVA) i del gen IDI1 (codifica isopentenil pirofosfat isomerasa, que catalitza la isomerització dels substrats de la farnesil pirofosfat sintasa, FPPS). A més, la caracterització del rol de l'enzim FPPS en la disponibilitat de GPP per al seu aprofitament per l'enzim linalol sintasa de Clarkia breweri, va derivar en una producció de linalol 50 vegades major en soques en les que una versió modificada en el seu centre actiu (K197E), codificada per l'al¿lel erg20-2, reemplaçava a l'enzim silvestre (codificada per ERG20); aconseguint una millora global de 80 vegades respecte a la producció de linalol inicial (14,51 ± 0,90 µg/L), en sobreexpressar conjuntament el gen IDI1 i l'al¿lel erg20-2 en soques productores de linalol que no tenen la funció FPPS endògena (1144,68 ± 139,39 µg/L). Les soques productores de geraniol (expressen el gen GES que en Ocimum basilicum -alfàbrega- codifica geraniol sintasa) derivades de T73 es van incloure en assajos de microvinificació i la concentració d'aquest monoterpè en el vi final no només va estar per sobre del seu llindar de percepció, sinó que es va produir una dispersió metabòlica del geraniol cap a altres monoterpens (linalol, nerol i citronel¿lol) i èsters (geranil i citronel¿lil acetat) aromàtics. A més, l'increment de la producció de monoterpens observat en condicions de laboratori en soques que sobreexpressen el gen IDI1 es va reproduir en aquests assajos, demostrant que la modificació de passos clau de la ruta MVA és una estratègia vàlida per modular i/o millorar l'aroma del vi.