Optimización de marcadores moleculares para el manejo de un conjunto de líneas de introgresión de Solanum lycopersicoides en el fondo genético del tomate cultivado

Abstract

[EN] Solanum lycopersicoides is the most distant tomato relative that has been crossed with tomato to obtain fertile progeny, the interspecific hybrid. Several researchers developed a set of introgression lines (ILs) of S. lycopersicoides in the genetic background of the cultivated tomato, S. lycopersicum. This collection is a useful tool for mapping. However, some of these lines are kept in heterozygous state due to infertility in homozygous state. Molecular markers, which determine the presence of S. lycopersicoides fragment in segregating lines, are need for the properly management and evaluation of the ILs collection. The purpose of this Master´s Thesis was to validate a set of CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) described in previous works by the research group for managing ILs collection. Some of these CAPS have been tested in both parental lines (S. lycopersicum VF36 and S. lycopersicoides LA2951) so, in these cases, it was necessary to check whether preferential amplification in heterozygous individuals occurred. For the other CAPS, a confirmation of amplification conditions, as well as the fragment size, was applied for all three genotypes; both parental lines and the 90L4178-1 interspecific hybrid. PCR amplification and restriction enzymes digestion, when no PCR polymorphism was observed, were performed. After PCR, 25 out of 34 CAPS analyzed in the present work were amplified in both parental lines and in the 90L4178-1 interspecific hybrid using the conditions previously described. Several amplification fails occurred; four CAPS (C2-20, CT75, TG230 and TG46) produced non-specific amplification products, other four CAPS (CT67, TG244, TG342 and C2-22) did not produce amplification product at least in one genotype and C2-21 amplified poor quality product. The polymorphism in five CAPS was detected by PCR amplification using the conditions previously described, whereas for the remaining CAPS a digestion of the amplification product using a restriction enzyme was need. In that case, 18 out of 20 CAPS were digested using a restriction enzyme previously described, while different restriction enzymes were tested for the two remaining CAPS and also for no polymorphic CAPS after digestion with the enzyme previously described. Nine out 18 CAPS obtained the same fragment size previously described after digestion, distinguishing the three genotypes. Six out the nine remaining CAPS allowed the differentiation of all genotypes, although the fragment patterns differed from previous information. Finally, polymorphisms among genotypes were not obtained for two CAPS (CT190 and C2-3) and no clear fragment pattern after digestion was obtained for CT233. The CT115 CAPS was described as polymorphic among genotypes after MseI restriction enzyme digestion. Therefore, 21 markers (C2-2, CT188, TG498, TG176, TG302, C2-19, TG337, C2-1, C2-6, C2-7, C2-15, TG510, TG497, C2-33, C2-10, TG393, C2-5, C2-8, TG63, TG303 and CT115) can be used to analyze ILs segregation that have introgressions in heterozygous state. Polymorphisms between parental lines for CT190, TG114, C2-3 and CT233 CAPS should be looked for in the future, and thereafter these polymorphisms should be check in the interspecific hybrid.

[ES] Solanum lycopersicoides es la especie más alejada del tomate cultivado, S. lycopersicum, con la cual ha sido posible obtener descendencia fértil a partir del híbrido interespecífico. Un grupo de investigadores desarrolló una colección de líneas de introgresión (ILs) de S. lycopersicoides en el fondo genético del tomate cultivado, S. lycopersicum. Esta colección constituye una herramienta útil para la cartografía de caracteres de interés. Debido a problemas de esterilidad, parte de las líneas deben mantenerse en heterocigosis. Para el manejo y evaluación de la colección es necesario disponer de marcadores moleculares que permitan determinar la presencia del fragmento de S. lycopersicoides en las líneas segregantes. El objetivo del presente Trabajo Final de Máster ha sido validar un conjunto de marcadores CAPS para el manejo de la colección de ILs, descritos en trabajos previos realizados por el grupo de investigación. Algunos de estos marcadores habían sido probados únicamente en los dos parentales de la colección de ILs (S. lycopersicum VF-36 y S. lycopersicoides LA2951); resultaba necesario comprobar, en estos casos, si en los individuos heterocigotos se producía amplificación preferencial de uno de los alelos. Para el resto de marcadores se trataba de confirmar las condiciones de la amplificación, así como el patrón de bandas correspondiente a cada genotipo. Se realizó la amplificación mediante PCR y la digestión mediante enzimas de restricción en los casos en que era necesario, a partir de los parentales de la colección de ILs y el híbrido interespecífico 90L4178-1. Para algunos de los marcadores para los que previamente no se había descrito una enzima de corte específico que generase polimorfismo, se probaron algunas enzimas de restricción. Para 25 de los 34 marcadores analizados se ha obtenido producto de amplificación en ambos parentales y el híbrido interespecífico en las condiciones previamente descritas. Cuatro de los marcadores analizados (C2-20, CT75, TG230 y TG46) han producido una amplificación inespecífica en las condiciones previamente descritas, para otros cuatro marcadores (CT67, TG244, TG342 y C2-22) no se ha obtenido producto de amplificación para alguno de los genotipos en las condiciones previamente descritas y para el marcador C2-21 la amplificación ha sido de mala calidad. Se ha detectado polimorfismo a nivel de la amplificación mediante PCR en cinco de los 25 marcadores que han amplificado correctamente en las condiciones previamente descritas, distinguiéndose los tres genotipos. Para 18 de los 20 marcadores restantes ha sido necesario digerir el producto de amplificación empleando una enzima de restricción previamente descrita, mientras se han probado nuevas enzimas para los dos marcadores restantes y para un marcador que no ha generado polimorfismo tras la digestión con la enzima previamente descrita. Para nueve de los 18 marcadores los fragmentos obtenidos tras la digestión coinciden con los previamente descritos, distinguiéndose los tres genotipos. Seis de los nueve marcadores restantes han permitido la diferenciación de los tres genotipos, siendo el patrón de bandas diferente al obtenido por otros autores. Por último, dos marcadores (CT190 y C2-3) no han generado polimorfismo entre los genotipos y para uno (CT233) no ha sido posible obtener fragmentos claros tras la digestión. De las enzimas probadas por primera vez, solo se ha observado polimorfismo entre los tres genotipos tras la digestión con la enzima de restricción MseI en el marcador CT115. Por tanto, 21 marcadores (C2-2, CT188, TG498, TG176, TG302, C2-19, TG337, C2-1, C2-6, C2-7, C2-15, TG510, TG497, C2-33, C2-10, TG393, C2-5, C2-8, TG63, TG303 y CT115) pueden ser utilizados para analizar la segregación en líneas de introgresión que presentan el fragmento introgresado en heterocigosis. Para poder emplear los marcadores CT190, TG114, C2-3 y CT233 sería necesario encontrar una enzima que generase polimorfismo entre VF36 y LA2951, comprobando posteriormente que en el híbrido se amplifican ambos alelos de forma eficiente.