Fungemias invasoras en la Unidad de Grandes Quemados: identificación y estudio de la sensibilidad a los antifúngicos de los aislados formadores y no formadores de biopelículas

Abstract

[EN] Invasive Fungemias in a Burns Unit: Identification and Study of Susceptibility to Antifungal Agents of both Biofilm-forming and Non-biofilm Forming Isolates Background: About 15-30% of nosocomial invasive fungemia in hospitalized patients are caused by Candida spp., they being the forth cause of nosocomial infections. Burns patients are at a high risk of acquiring local or systemic infections. Most of them die due to multi-organic failure or sepsis. Furthermore, the infections caused by biofilm-forming micro-organisms are more resistant to antimicrobial treatments. Candidemia crude mortality rate is generally above 30% but ranges from 14 to 70% in burns patients. The majority of studies on infections in these patients deal with those caused by bacteria but there are few on infections caused by yeasts and even fewer on those caused by biofilm-forming micro-organisms. Objective: the aim of this study was: 1) to identify the yeast species causing fungemias isolated during 17 years (January 1996 to December 2012) from patients in the Burns Unit at the University and Polytechnic Hospital La Fe, Valencia, Spain; 2) to identify which of them produce biofilms; 3) to study the susceptibility of isolates to amphotericin B and anidulafungin, both in planktonic cells (suspension) and in biofilms (sessile), by determining the minimal inhibitory concentration (MIC). Material and methods: identification of yeasts was carried out by biochemical and enzymatic tests (CHROMagar, Auxacolor and VITEK 2). The method used to identify the biofilm-forming yeasts was that described by Ramage et al. with modifications introduced by Valentin et al. based on reduction of XTT. This method measures the metabolic activity of the cells in the biofilm. The activity of anidulafungin and amphotericin B against planktonic cells was determined using the reference broth microdilution method of Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI), documents M27-A3 and the clinical breakpoint applied were those of document M27-S4; and against biofilms the inhibition of metabolisms was measured by the XTT reduction method. Results: A total of 41 yeast isolates were obtained from 38 episodes of fungemia in 37 patients. Three episodes were mixed and one patient had two episodes in six months. The species and percentage of isolates were: 53.7% Candida albicans; 19.5% Candida parapsilosis; 9.8% Candida orthopsilosis; 4.9% Candida tropicalis; 4.9% Candida glabrata; 4.9% Candida krusei; and 2.4% Trichosporon asahii. Thirteen isolates were biofilm forming, C. albicans being the most productive species (46.1%), followed by C. parapsilosis (23.1%), C. orthopsilosis (15.4%), C. tropicalis (7.7%) and C. glabrata (7.7%). According to the clinical breakpoints established by the CLSI (document M27-S4), all isolates in planktonic form were susceptible to anidulafungin, except for the T. asahii. With respect to amphotericin B, the MIC values were ≤1mg/L, except for two isolates that required more than 2 mg/L to be inhibited (C. parapsilosis and C. krusei). Against preformed biofilms, amphotericin B was the most active: it inhibited 50% of metabolisms at concentrations ≤0.5 mg/L except for one C. albicans biofilm that was also resistant to anidulafungin. By contrast, the activity of anidulafungin was species and isolate dependent, C. parapsilosis biofilms being resistant to this agent. The concentrations required to inhibit 50% of biofilm metabolism ranged from 0.016 to >16 mg/L. Conclusion: there has been a significant increase in fungemias caused by non-C. albicans species during the 17 years covered by this study. C. albicans was the most frequent species isolated in blood culture in the Burns Unit and formed the most biofilms. Anidulafungin was the most active against planktonic cells and amphotericin B against the preformed biofilms. Further studies are required in order to correlate both susceptibility to antifungal agents and the clinical evolution of patients with fungemias caused by biofilm forming and non forming isolates.

[ES] Antecedentes: las fungemias y/o fungemias invasoras suponen alrededor de un 15-30% de las infecciones nosocomiales en pacientes ingresados, las especies de Candida son la cuarta causa más frecuente. Los pacientes con quemaduras graves tienen mayor riesgo de infecciones locales y sistémicas. Muchos de estos pacientes, no mueren por las heridas sino por la sepsis y/o fallo multiorgánico. Además, las infecciones producidas por microorganismos capaces de desarrollar biopelículas son más recalcitrantes al tratamiento. La tasa de mortalidad atribuible a la candidemia es mayor del 30% y en los pacientes quemados oscila entre el 14 y 70%. La relevancia del estudio de estas infecciones en quemados radica en la escasez de información sobre este grupo de pacientes donde se tienen más conocimiento sobre las infecciones bacterianas que sobre las fúngicas. Objetivo: 1) Identificar las especies de levaduras causantes de fungemias en los pacientes ingresados en la Unidad de Grandes Quemados del Hospital Universitario y Politécnico La Fe durante un periodo de 17 años (Enero 1996- diciembre 2012); 2) Identificar entre ellos los productores de biopelículas; 3) Estudiar la sensibilidad de los aislados en forma planctónica (suspensión) y en biopelículas (sésiles) a los antifúngicos anidulafungina y anfotericina B. Material y métodos: la identificación de las levaduras se realizó mediante pruebas bioquímicas y enzimáticas (CHROMagar, Auxacolor y Vitek 2). Para determinar la capacidad de formar biopelículas, se utilizó el método de reducción del XTT descrito por Ramage et al. con algunas modificaciones introducidas por Valentín et al. Este método mide la actividad metabólica de las células que forman la biopelícula. La actividad de anidulafungina y anfotericina B sobre las células planctónicas se determinó utilizando el método de referencia de microdilución en caldo del Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI), documento M27-A3 y los puntos de corte clínicos aplicados los del documento M27-S4; y para las biopelículas se midió la inhibición de la actividad metabólica de la biopelícula, producida por el antifúngico, a través de los ensayos de reducción del XTT. Resultados: Durante el período de estudio se aislaron 41 levaduras en 38 episodios de candidemia de 37 pacientes. Las especies y porcentaje de aislados fueron: 53,7% Candida albicans, 19,5% Candida parapsilosis, 9,8% Candida orthopsilosis, 4,9% Candida tropicalis, 4,9% Candida glabrata, 4,9% Candida krusei y 2,4% Trichosporon asahii. Se identificaron 13 aislados productores de biopelículas siendo C. albicans la especie más representativa (46,1%), seguida de C. parapsilosis (23,1%), C. orthopsilosis (15,4%), C. tropicalis (7,7%) y C. glabrata (7,7%). Según los puntos de corte clínicos establecidos por el CLSI, todos los aislados en estado planctónico fueron sensibles a anidulafungina excepto T. asahii; y para anfotericina B, sólo se observaron dos aislados que requerían concentraciones superiores a 2 mg/L (C. parapsilosis y C. krusei). Sobre las biopelículas, anfotericina B fue más activa; requiere concentraciones ≤0,5 mg/L para inhibir el 50% del metabolismo, excepto la biopelícula de un aislado de C. albicans que fue resistente a los dos antifúngicos. En cambio, la actividad de anidulafungina dependió de la especie y del aislado, las concentraciones necesarias para inhibir el 50% del metabolismo oscilaron entre 0,016 y >16 mg/L. Las biopelículas de C. parapsilosis fueron resistente a anidulafungina. Conclusiones: A lo largo de los 17 años, se ha observado un aumento significativo de las fungemias producidas por especies de Candida no-albicans (p ≤ 0,05). C. albicans es la especie más frecuentemente aislada de hemocultivos en la Unidad de Grandes Quemados y la más productora de biopelículas. Anidulafungina actúa con mayor eficacia sobre las células en suspensión, mientras que anfotericina B posee mayor actividad sobre las biopelículas, aunque la sensibilidad depende de la especie y del aislado. Se requieren nuevos estudios para correlacionar la sensibilidad a los antifúngicos y la evolución clínica de los pacientes con las fungemias producidas por levaduras formadoras y no formadoras de biopelículas