Papel de la composición de esfingolípidos en los procesos de respiración y adaptación

Abstract

[EN] In the present work the physiological consequences of sphingolipid degradation was studied, which is conserved between yeast and humans. In this metabolic pathway, sphingosine–1–phosphate and dihydrosphingosine are converted to palmitoyl – CoA. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the enzymes involved in this process are: Lcb4, Lcb5, Dpl1, Hfd1, Faa1 and Faa4. Furthermore, the Hfd1 protein is of special interest in biomedicine because of the ortholog in humans, the ALDH3A2 protein, a fatty aldehyde dehydrogenase which, like yeast Hfd1, catalyses the conversion of hexadecenal to hexadecenoic acid in the pathway mentioned. Mutations in the gene encoding ALDH3A2 cause the Sjögren – Larsson syndrome in humans. To further explore this metabolic pathway and the proteins that are involved in it, experiments were performed to characterize their functions in the processes of mitochondrial respiration and adaptation to stress. First, a phenotypic analysis of the mutant strains affected in the degradation of sphingolipids (Δlcb4, Δlcb5, Δdpl1, Δhfd1, Δfaa1 and Δfaa4) was performed. By using the Bioscreen method, growth of the mutant strains relative to the wild type strain BY4741 was studied under salt stress conditions (NaCl), toxic cation stress conditions (Hygromycin B) and respiratory conditions (glycerol as carbon source). Loss of Hfd1, Lcb5 and Dpl1 function caused a slight growth delay upon NaCl stress conditions. All mutant strains showed growth retardation in the case of Hygromycin B stress. Exclusively the Δlcb5 mutant was unable to grow under respiratory conditions. An analysis of gene expression of the HFD1, FAA1, FAA4, DPL1, LCB4 and LCB5 genes in response to salt stress was performed through a literature search of the data obtained by Li Ni et al. (2009). Generally, activation of all genes along the salt shock was observed, except FAA4, and with HFD1 and FAA1 showing the greatest induction. A quantitative comparison of the levels of accumulation of intracellular sodium in mutants affected in the degradation of sphingosine–1–phosphate was performed. The Δhfd1 and Δfaa1 mutants showed a slightly higher accumulation of sodium ions relative to other mutants compared to wild type. Additionally, the O2 consumption of the mutant strains of the pathway in study was quantified and the Δlcb5 mutant was characterized with a severely reduced respiration rate. The Δlcb5 mutant was further characterized by comparing the growth in different respiratory media with different carbon sources, with respect to the mutant in its isoenzyme Lcb4 and the wild type. Lcb5 is partially needed for efficient growth on galactose and completely required to sustain growth with glycerol, ethanol or lactate as the carbon source. The mitochondrial morphology was studied by fluorescence microscopy in the Δlcb5 mutant using MitoTracker® Red CM- H2XROS. No defects in mitochondrial morphology in fermentative medium or in respiratory medium were detected. Finally, the intracellular localization of the Hfd1 protein was studied by confocal microscopy in fermentative and respiratory conditions. We confirmed that Hfd1 is not an integral protein of the mitochondria, but that its location is close to the mitochondria and to the plasma membrane.

[ES] En el presente trabajo se estudió el proceso de degradación de esfingolípidos que está conservado entre levaduras y humanos. En esta ruta metabólica, la esfingosina-1-fosfato y la dihidroesfingosina, se convierten en palmitoil-CoA. Las enzimas de la levadura Saccharomyces cerevisiae que están implicadas en este proceso son: Lcb4, Lcb5, Dpl1, Hfd1, Faa1 y Faa4. Por otro lado, la proteína Hfd1 tiene un interés especial en biomedicina, debido a que posee un ortólogo en humanos, la proteína ALDH3A2, que es una deshidrogenasa de aldehídos grasos que se encarga de realizar la conversión de hexadecenal a ácido hexadecenoico en la ruta comentada (al igual que ocurre con la proteína Hfd1 en levadura). Mutaciones en el gen que codifica para la proteína ALDH3A2 provoca, en humanos, el Síndrome de Sjögren-Larsson. Para poder estudiar con mayor profundidad esta ruta metabólica y las proteínas que están implicadas en la misma, se realizaron experimentos para relacionarlas con procesos de respiración y adaptación a estrés. En primer lugar se realizó un análisis fenotípico de las cepas mutantes afectadas en la degradación de esfingolípidos (Δlcb4, Δlcb5, Δdpl1, Δhfd1, Δfaa1 y Δfaa4). Mediante el método Bioscreen, se comparó el crecimiento de las cepas mutantes con respecto a la cepa silvestre BY4741, en condiciones de estrés causado por NaCl para estudiar la tolerancia a estrés salino, estrés causado por Higromicina B para estudiar la tolerancia a cationes tóxicos y en condiciones respiratorias (glicerol) para estudiar el crecimiento respiratorio. La pérdida de función de Hfd1, Dpl1 y Lcb5 causaba un ligero retraso de crecimiento bajo condiciones de estrés por NaCl. Todas las cepas mutantes de la ruta mostraron un retraso en su crecimiento en el caso del estrés causado por Higromicina B. Y sólo el mutante Δlcb5 es incapaz de crecer en condiciones respiratorias. En segundo lugar, se realizó un análisis de la expresión génica de los genes HFD1, FAA1, FAA4, DPL1, LCB4 y LCB5 en respuesta a estrés osmótico, mediante una búsqueda bibliográfica de los datos obtenidos por Li Ni et al. (2009). Se encontró una activación generalizada de los genes a lo largo del choque salino con la excepción de FAA4 y con HFD1 y FAA1 mostrando una mayor inducción. En tercer lugar se realizó una comparación cuantitativa de los niveles de acumulación de sodio intracelular en mutantes afectados en la degradación de la esfingosina-1-fosfato. Los mutantes Δhfd1 y Δfaa1, fueron los que mostraron una mayor acumulación de iones sodio con respecto al resto de mutantes en comparación con la cepa silvestre. En cuarto lugar se realizó una cuantificación del consumo de O2 de las cepas mutantes de la ruta en estudio y se caracterizó el mutante Δlcb5 con una tasa de respiración severamente reducida. En quinto lugar se caracterizó el mutante Δlcb5 comparando su crecimiento en diferentes medios respiratorios con diferentes fuentes de carbono, con respecto al mutante en su isoenzima Lcb4 y a la cepa silvestre. Lcb5 tiene una importancia parcial en condiciones respiratorias en que la fuente de carbono es galactosa y total en el caso de glicerol, etanol y lactato. En sexto lugar, se estudió mediante microscopía de fluorescencia la morfología mitocondrial del mutante Δlcb5, empleando MitoTracker® Red CM-H2XROS. Se pudo confirmar que este mutante no muestra defectos en la morfología mitocondrial en medio fermentativo y en medio respiratorio. Por último, se estudió mediante microscopía confocal la localización intracelular de la proteína Hfd1, en condiciones fermentativas y en condiciones respiratorias. Hfd1 no es una proteína integral de la mitocondria, pero se localiza cerca de la mitocondria y de la membrana plasmática