Análisis de las interacciones moleculares del supresor del silenciamiento por RNA del virus del arabesco del Pelargonium

Abstract

[EN] RNA silencing processes play an essential role in plant responses against exogenous nucleic acids such as transgenes, transposons or viruses. Viral-derived double-stranded RNAs (dsRNAs) trigger this type of processes as they are recognized by RNase III-type enzymes, called Dicer-like (DCL), and digested into small RNAs (sRNAs) of 20-24 nt. Then, one strand of those sRNAs is incorporated into an RNA-induced silencing complex (RISC) whose main component is an Argonaute (AGO) protein.. Within the activated RISC, the sRNA act as guide to bring the RISC complex into contact with complementary RNA and thereby cause their degradation. To counteract this host defense barrier, most plant viruses encode suppressors of RNA silencing (VSR). Such VSRs are structurally diverse and their mechanisms of action may differ and are often not well understood. Though virtually all stages of the antiviral silencing pathway can be inhibited by VSRs, sRNAs and AGO proteins seem to be the most common targets. Recently, GW/WG motifs present at the sequence of some VSRs have been proposed to dictate their suppressor activity by directing interaction with AGOs. In this work, we have studied the VSR encoded by Pelargonium line pattern virus (PLPV), a member of the family Tombusviridae that causes frequent infections in geranium. Previous experiments have shown that the viral coat protein of PLPV (CP or p37) acts as a VSR. In order to get insights into the mode of action of this suppressor, different protein motifs have been modified by site directed mutagenesis, including a GW motif conserved in homologous proteins, generating suppressor-competent and incompetent molecules and uncoupling the VSR and particle assembly capacities. The engineered mutants have been used, on the one hand, to assess the importance of the silencing suppression and the encapsidation functions of p37 for viral infection and, on the other hand, to analyze different molecular interactions of p37 (sRNAs binding, dimerization, subcellular localization, association with AGO proteins) in an attempt to establish possible correlations between such interactions and the suppression activity. Two main conclusions can be drawn from this work: (i) the silencing suppression and encapsidation functions of p37 are both required for systemic PLPV infection and, (ii) p37 inhibits silencing most likely through sequestration of sRNAs, preventing the activation of RISC.

[ES] Los procesos de silenciamiento por RNA constituyen uno de los principales mecanismos de respuesta de las plantas frente a ácidos nucleicos exógenos, como transgenes, transposones o virus. Este mecanismo es activado por RNAs virales de doble cadena (double stranded RNAs, dsRNAs), producidos en el curso de la infección, que son reconocidos por RNasas III de tipo Dicer, cuya acción genera pequeños RNAs (small RNAs, sRNAs) de entre 20 y 24 nt. A continuación, una de las cadenas de esos sRNAs es incorporada a un complejo multiproteico conocido como RISC (RNA-induced silencing complex), cuyo componente principal es un endonucleasa de la familia de las Argonautas (AGO). Una vez activado, RISC es dirigido por el sRNA asociado hasta RNAs de secuencia complementaria provocando su degradación. Con el fin de evadir esta respuesta defensiva del huésped, los virus codifican proteínas conocidas como supresores del silenciamiento por RNA (viral RNA silencing suppressors, VSRs). Los VSRs son muy diversos en cuanto a tamaño y secuencia, y las bases moleculares de su actividad no se conocen con precisión en muchos casos. Aunque todas las etapas de la ruta de silenciamiento pueden ser inhibidas por los VSR, los sRNAs y las proteínas AGO parecen ser las dianas más frecuentes. Recientemente se ha propuesto que los motivos GW/WG presentes en la secuencia de algunos VSR son los que dictaminan su función supresora por interacción directa con las AGOs. Este trabajo se ha centrado en el estudio del VSR codificado por el virus del arabesco del Pelargonium (Pelargonium line pattern virus, PLPV), un miembro de la familia Tombusviridae que causa infecciones frecuentes en geranio. Experimentos anteriores habían permitido identificar a la proteína de cubierta viral (CP o p37) como el VSR del PLPV. Para tratar de obtener datos acerca del modo de acción de este supresor, se han modificado mediante mutagénesis dirigida distintos motivos de la proteína, incluido un motivo GW que está conservado en proteínas homólogas, y se ha obtenido una batería de moléculas capaces e incapaces de actuar como VSR y/o de empaquetar el RNA viral. Esta batería de moléculas ha permitido, por una parte, evaluar la importancia de las funciones de supresión del silenciamiento y de encapsidación de p37 para la infección viral y, por otra, analizar distintas interacciones moleculares de p37 (unión a sRNAs, dimerización, localización subcelular, asociación con proteínas AGO) y establecer posibles correlaciones entre las mismas y la actividad supresora. Dos conclusiones principales se pueden extraer de este trabajo: (i) tanto la función de supresión del silenciamiento como la función de encapsidación de p37 son necesarias para la infección sistémica del PLPV y, (ii) p37 inhibe el silenciamiento, muy probablemente, a a través del secuestro de sRNAs, impidiendo la activación de RISC.