Protein kinases and phosphatases regulating the yeast proton pump

Abstract

[EN] The plasma membrane H+-ATPase (Pma1) is essential for yeast growth and is activated by glucose metabolism by an unknown mechanism involving double phosphorylation of a regulatory site at the C-terminus (Ser911 Thr912). In this thesis we have investigated in Saccharomyces cerevisiae the role of two protein phosphatases, type 1 Glc7 and type 2A Sit4, and of an essential atypical protein kinase, TORC1, in the activation of Pma1 by glucose. The regulatory site of activated Pma1 can be dephosphorylated "in vitro" by recombinant Glc7 and Sit4, but inhibition "in vivo" of these phosphatases does not activate Pma1. Inhibition of Glc7 by regulated expression of a dominant-negative truncated form (the null mutant is not viable) had no effect on Pma1 activity while deletion of SIT4 gene decreased both Pma1 activity and double phosphorylation of the regulatory site. Inhibition of TORC1 protein kinase by treatment of yeast cells with the drug rapamycin or by exposure to non-permissive temperature of a temperature-sensitive mutant (tor1¿ tor2ts) inhibited Pma1 and decreased double phosphorylation of the regulatory site. We conclude that Sit4 and TORC1 are required for full activation of Pma1 by glucose while Glc7 either does not participate or is redundant with other phosphatases.

[ES] La H+-ATPasa de la membrana plasmática (Pma1) es esencial para el crecimiento de la levadura y se activa por metabolismo de glucosa por un mecanismo desconocido que lleva consigo la doble fosforilación de un sitio regulador en el extremo C-terminal (Ser911 Thr912). En la presente tesis hemos investigado en Saccharomyces cerevisiae la participación de dos proteína fosfatasas, Glc7 de tipo 1 y Sit4 de tipo 2A, y de una proteína kinasa atípica esencial, TORC1, en la activación de Pma1 por glucosa. El sitio regulador de Pma1 en su estado activo puede defosforilarse "in vitro" por Glc7 y Sit4 recombinantes pero la inhibición "in vivo" de estas fosfatasas no activa Pma1. La inhibición de Glc7 mediante la expresión regulada de una forma truncada que actúa como dominante-negativa (el mutante nulo no es viable) no tiene efecto en la actividad de Pma1 mientras que la deleción del gen SIT4 disminuye tanto la actividad de Pma1 como la doble fosforilación del sitio regulador. Inhibición de la proteína kinasa TORC1 mediante tratamiento de las células de levadura con el fármaco rapamicina o exponiéndolas a temperatura no permisiva en el caso de un mutante termosensible (tor1¿ tor2ts) resulta en inhibición de Pma1 y disminución de la doble fosforilación del sitio regulador. Estos resultados indican que Sit4 y TORC1 son necesarias para la máxima activación de Pma1 por glucosa mientras que Glc7 podría no participar o hacerlo de forma redundante con otras fosfatasas.

[CA] L'H+-ATPasa de la membrana plasmàtica (Pma1) és essencial per al creixement dels llevats i s'activa gràcies al metabolisme de glucosa per un mecanisme desconegut que porta associat la doble fosforilació d'una regió reguladora a l'extrem C-terminal (Ser911 Thr912). En aquesta tesi hem investigat en Saccharomyces cerevisiae la participació de dos proteïnes fosfatases, Glc7 de tipus 1 i Sit4 de tipus 2A, i d'una proteïna quinasa essencial atípica, TORC1, en l'activació de Pma1 per glucosa. La regió reguladora de Pma1, en seu estat activat, pot desfosforar-se "in vitro" per Glc7 i Sit4 recombinants, però la inhibició "in vivo" d'aquestes fosfatases no activa Pma1. La inhibició de Glc7 mitjançant l'expressió regulada d'una forma truncada que actua com a dominant-negativa (el mutant nul no és viable) no té cap efecte en l'activitat de Pma1 mentre que la deleció del gen SIT4 disminueix tant l'activitat de Pma1 com la doble fosforilació de la regió reguladora. La inhibició de la proteïna quinasa TORC mitjançant un tractament de cèl·lules de llevat amb el fàrmac rapamicina o la seua exposició a temperatures no permissives en el cas d'un mutant termosensible (tor1¿ tor2ts) resulta en la inhibició de Pma1 i la disminució de la doble fosforilació de la regió reguladora. Aquests resultats indiquen que Sit4 i TORC1 són necessàries per a l'activació màxima de Pma1 per glucosa, mentre que Glc7 podria no participar o fer-ho d'una forma redundant amb altres fosfatases.