Structural, biophysical and functional characterization of Nop7-Erb1-Ytm1 complex and its implications in eukaryotic ribosome biogenesis

Abstract

[EN] Ribosome biogenesis is one of the most important and energy-consuming processes in the cell. However, the vast majority of the events and factors that are involved in the synthesis of ribosomal subunits are not well understood. Ribosome maturation comprises multiple steps of rRNA processing that require sequential association and dissociation of numerous assembly factors. These proteins establish a complex network of interactions that are essential for the pathway to continue. Extensive studies in Saccharomyces cerevisiae allowed to identify some of the genetic and functional correlations between the pre-ribosomal factors that could be organized into interdependent clusters or sub-complexes. A heterotrimer formed by Nop7, Erb1 and Ytm1 (PeBoW complex in mammals) is crucial for the proper formation of the 60S subunit. Depletion of any of the three proteins is inviable and certain truncations result in aberrant processing of 27SA2 rRNA thus impairing cell proliferation. Nop7 and Erb1 have been shown to bind RNA and are recruited to the pre60S before Ytm1. It is also known that the trimer has to be removed from the nascent particle in order to promote its normal maturation. Despite its relevance in the cell, the exact role of PeBoW is not clear and the interactions within the complex have been poorly characterized. In this study we carry out an extensive biochemical and structural analysis of Nop7-Erb1-Ytm1 trimer from S. cerevisiae and from a thermophilic fungus Chaetomium thermophilum. We have been able to reconstitute a stable complex in vitro that was then used in crystallographic trials. We have solved the structure of the C-terminal domain of Erb1 from yeast that folds into a seven-bladed ß-propeller. We prove that this part of the protein binds RNA in vitro, a property that might be important for its function. Moreover, in spite of previous reports suggesting that the ß-propeller domain of Erb1 would not be essential for ribosome biogenesis, we could solve the crystal structure of Ytm1 bound to the carboxy-terminal portion of Erb1 from C. thermophilum. That finding led us to redefine the macromolecular interactions that hold the complex together. First, we have verified that the N-terminal region of Nop7 interacts with Erb1. Furthermore, we have shown that a good affinity binding takes place in vitro between WD40 domain of Ytm1 and the ß-propeller of Erb1. Upon careful analysis of the interface involved in dimer formation we have designed a mutant of Erb1 that exhibits weaker association with Ytm1. We confirm our structural and biophysical data using S. cerevisiae. We prove that a point mutation that decreases the affinity between propellers of Erb1 and Ytm1 negatively affects growth in yeast because it interferes with 60S production. We show that a very conserved interface of protein-protein interaction could be targeted in order to hinder cell proliferation.

[ES] El ensamblaje de ribosomas es uno de los procesos más importantes y costosos energéticamente en una célula eucariota. A pesar de ello, se sabe relativamente poco acerca de la gran mayoría de los eventos y factores implicados en la síntesis de las subunidades ribosomales. La maduración de ribosomas comprende numerosos pasos de procesamiento del rRNA que requieren la asociación y disociación de más de doscientos factores de ensamblaje. Esas proteínas establecen una compleja red de interacciones que son esenciales para que el proceso pueda llevarse a cabo. Los estudios realizados en Saccharomyces cerevisiae han permitido la identificación de algunas correlaciones genéticas y funcionales entre los factores prerribosomales. Es el caso del heterotrímero formado por Nop7, Erb1 e Ytm1 (complejo PeBoW en mamíferos), que es imprescindible para la correcta formación de la subunidad 60S. La ausencia de cualquiera de las tres proteínas es inviable y también se conocen ciertas variantes truncadas que alteran el procesamiento del rRNA 27SA2 y de este modo afectan la proliferación celular. Se ha demostrado que Nop7 y Erb1 se asocian al rRNA y que su reclutamiento al pre60S ocurre antes de la unión a Ytm1. Además se sabe que el trímero tiene que separarse de la partícula prerribosomal emergente con el fin de favorecer su maduración. A pesar de su gran relevancia en la célula, no está claro el papel exacto del complejo PeBoW y tampoco se dispone de conocimientos suficientes acerca de las interacciones intermoleculares que lo mantienen. Durante el desarrollo de este proyecto se ha llevado a cabo un exhaustivo análisis bioquímico y estructural del trímero Nop7-Erb1-Ytm1 procedente de S. cerevisiae y del hongo termofílico Chaetomium thermophilum. En este trabajo hemos sido capaces de reconstituir el complejo estable in vitro que posteriormente se ha utilizado en los ensayos de cristalización, con los que hemos podido resolver la estructura del dominio carboxi-terminal de Erb1 de levadura, cuyo plegamiento corresponde a una hélice enrollada (ß-propeller) de siete hojas. Gracias a la información estructural, hemos demostrado que esa parte de la proteína es capaz de unir RNA in vitro, lo que puede ser una propiedad importante para su función. Además, a pesar de los estudios anteriores que sugerían que la hélice enrollada de Erb1 no era esencial en la biogénesis del ribosoma, hemos resuelto la estructura cristalina de la proteína Ytm1 unida al dominio C-terminal de Erb1 de C. thermophilum. Ese descubrimiento nos ha permitido redefinir las interacciones macromoleculares que mantienen el complejo. Inicialmente hemos confirmado que el extremo amino-terminal de Nop7 interacciona con Erb1. A continuación, hemos demostrado que el dominio WD40 de Ytm1 se une al ß-propeller de Erb1 con una buena afinidad. Después de un detallado análisis de la superficie involucrada en la formación del dímero, hemos sido capaces de diseñar una variante mutada de Erb1 que se asocia más débilmente con Ytm1. Los hallazgos estructurales y biofísicos se han confirmado in vivo usando S. cerevisiae donde hemos demostrado que una mutación puntual que disminuye la afinidad de unión entre los dominios C-terminales de Erb1 e Ytm1 manifiesta un efecto negativo sobre el crecimiento de levadura porque interfiere con la síntesis de 60S. Nuestros resultados establecen un buen ejemplo de una superficie conservada involucrada en interacciones proteína-proteína, que podría considerarse una buena diana para inhibir la proliferación celular eucariota.

[CA] L'ensamblatge de ribosomes és un dels processos més importants i energèticament costosos en una cèl·lula eucariota. Tot i això, es coneix relativament poc de la majoria dels factors implicats en la síntesi de les subunitats ribosomals. La maduració de ribosomes compren moltes etapes de processament del rRNA que requereix l'associació i dissociació de més de dos-cents factors d'ensamblatge. Aquestes proteïnes estableixen una complexa xarxa de interaccions que són essencials perquè el procés es pugi dur a terme. Els estudis realitzats en Saccharomyces cerevisiae han permès la identificació de algunes correlacions genètiques i funcionals entre els factors pre-ribosomals. Aquest és el cas del heterotrímer comprés per Nop7, Erb1 i Ytm1 (complex PeBoW en mamífers), que és imprescindible per a la correcta formació de la subunitat 60S. L'absència de qualsevol de les tres proteïnes és inviable i també és coneixen certes variants truncades que alteren el processament del rRNA 27SA3 i que d'aquesta manera afecten a la proliferació cel·lular. S'ha demostrat que Nop7 i Erb1 s'associen al rRNA i que el seu reclutament al pre60S té lloc abans de l'unió a Ytm1. A més a més, es sap que el trímer ha de separar-se de la partícula pre-ribosomal emergent per tal que es produeixi la seua maduració. Malgrat la seua rellevància en la cèl·lula, no s'ha aclarit el paper exacte del complex PeBoW i tampoc n'hi ha coneixements suficients de les interaccions intermoleculars que el mantenen. Durant el desenvolupament d'aquest projecte s'ha dut a terme un exhaustiu anàlisi bioquímic i estructural del trímer Nop7-Erb1-Ytm1 de S. cerevisiae i del fong termofílic Chaetomium thermophilum. En aquest treball hem estat capaços de reconstituir el complex estable in vitro que posteriorment s'ha utilitzat en el assajos de cristal·lització, amb els que hem pogut resoldre l'estructura del domini carboxi-terminal de Erb1 de llevat i que té un plegament corresponent a una hèlix enrotllada (ß-propeller) de set fulles. Gràcies a la informació estructural, hem pogut demostrar que aquesta part de la proteïna té la capacitat d'unir RNA in vitro, el que pot ser una propietat important per a la seua funció. A més a més, malgrat que els estudis anteriors suggerien que la hèlix enrotllada de Erb1 no era essencial en la biogènesis del ribosoma, hem pogut resoldre la estructura cristal·lina de la proteïna Ytm1 unida al domini C-terminal de Erb1 de C. thermophilum. Aquest descobriment ens ha permès redefinir les interaccions macromoleculars que mantenen el complex. Inicialment, hem confirmat que l'extrem amino-terminal de Nop7 interacciona amb Erb1. A continuació, hem demostrat que el domini WD40 de Ytm1 s'uneix al ß-propeller de Erb1 amb bona afinitat. Després d'un anàlisi detallat de la superfície involucrada en la formació del dímer, hem estat capaços de dissenyar una variant mutada de Erb1 que s'associa més dèbilment amb Ytm1. Les dades estructurals i biofísiques s'han confirmat in vivo utilitzant S. cerevisiae on hem demostrat que una mutació puntual que disminueix l'afinitat d'unió entre els dominis C-terminals de Erb1 i Ytm1 manifesta un efecte negatiu en el creixement del llevat perquè interfereix amb la síntesi del 60S. Els nostres resultats estableixen un bon exemple de una superfície conservada involucrada en interaccions proteïna-proteïna, que es podria considerar una bona diana per a inhibir la proliferació cel·lular eucariota.