Integración de técnicas basadas en ADN para el desarrollo de biosensores aplicados en seguridad alimentaria

Abstract

[EN] Food security is guaranteed when there is sufficient, safe and nutritious food. This assurance must be satisfied throughout the entire production process, which is known as "safety from farm to fork". This results in a new way of addressing the problem with a global and comprehensive approach. To address this challenge, molecular techniques based on the use of nucleic acids are used in the analysis of certain food threatens, such as allergens, microorganisms, genetically modified organisms (GMOs), or food authentication. However, some of the described methods still have limitations, since they are expensive, complicated, and require specialized staff and equipment. Alternatively, biosensor technology provides reliable results in a simpler and faster way and with and added capabilities such as portability and automation, allowing to perform the analysis directly at points-of-control (POC). This thesis has focused on developing a biosensor system, based on compact disc technology, for the detection of nucleic acids in food safety applications and adaptable to POC needs. The carried out investigations have yielded new insights into gene technology, making interesting methodological contributions characterized by miniaturization, integration and automation. The first part of the research deals with the simplification of the amplification step, eluding the thermocycling by using alternatives to the polymerase chain reaction (PCR). To this end, two isothermal amplification techniques have been studied: the recombinase polymerase amplification (RPA) and the multiple displacement amplification (MDA). The detection was performed by hybridization assays with DNA probes immobilized in microarray format on the polycarbonate surface of a DVD. Furthermore, RPA amplification has been combined with detection by an immunoenzymatic assay (ELISA) for the simultaneous detection of multiple analytes. In another approach, amplification and hybridization have been integrated in a single step, further simplifying the analytical process. For that, the isothermal RPA amplification is performed in solid phase on the surface of the disc in different formats: drop, microfluidic chambers or micro-reactors. In the first two formats, the reactions take place at the surface of the DVD and the measurement is performed by recording the intensity of the reflected laser. In the third case the reaction is carried out in micro-wells embedded in the DVD substrate and the measurement is performed by measuring the intensity of the transmitted signal. Finally, a method to real time monitoring DNA synthesis has been developed, integrating the amplification and quantification steps. To this end, the isothermal loop mediated isothermal amplification reaction (LAMP) has been used. The monitoring of the reaction progress is performed by sequentially measuring colorimetric or turbidimetric changes in the reaction mixture. Thus each profile is related to the number of copies of each target gene, allowing their quantitation. The analytical properties (have been established for each methodology and the obtained results have been validated by comparison with reference techniques and by using certified samples. As proof of concept, the different developments have been applied to the detection and determination of the presence of allergens (hazelnut, peanut, soybean, tomato and maize), genetically modified organisms (p35S, tNOS and Bt-11), pathogenic bacteria (Salmonella spp., Cronobacter spp. and Campylobacter spp.), fungi (Fusarium spp.), as well as meat authentication.

[ES] La seguridad alimentaria está garantizada cuando se dispone de alimentos suficientes, nutritivos e inocuos. Esta garantía, además, ha de cumplirse a lo largo de todo el proceso productivo, lo que se conoce como "seguridad de la granja a la mesa". Nace así una nueva forma de abordar el problema, con un enfoque global y un tratamiento integral. Para afrontar este reto, las técnicas moleculares basadas en el empleo de ácidos nucleicos son, actualmente, utilizadas en la detección de amenazas alimentarias, como por ejemplo, alérgenos, microorganismos, organismos genéticamente modificados (OGM), o la autentificación de especies. Sin embargo, muchos de los métodos en uso presentan limitaciones, ya que son costosos, complicados, y requieren personal y equipamiento especializado. La tecnología de biosensores es una aproximación adecuada, ya que proporciona resultados fiables de manera sencilla y rápida, y con capacidades añadidas como portabilidad y automatización para llevar a cabo los ensayos directamente en puntos de control (POC). Esta tesis se ha centrado en el desarrollo de un sistema biosensor, basado en la tecnología de disco compacto, para la detección de ácidos nucleicos en aplicaciones de seguridad alimentaria adaptable a POC. Las investigaciones llevadas a cabo han permitido obtener nuevos conocimientos en tecnologías génicas, pudiendo efectuar aportaciones metodológicas de interés caracterizadas por su miniaturización, integración y automatización. En este sentido, una parte de la investigación aborda la simplificación de la etapa de amplificación del ADN diana, eludiendo el termociclado mediante el empleo de técnicas alternativas a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para ello, se han estudiado dos técnicas de amplificación isoterma, la amplificación por recombinasa polimerasa (RPA) y la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA). La detección se lleva a cabo mediante ensayos de hibridación con sondas de ADN inmovilizadas en formato micromatriz sobre la superficie de policarbonato de un DVD. Además, la amplificación por RPA se ha combinado con la detección mediante inmunoensayo ezimático (ELISA) para la determinación simultánea de múltiples analitos. En otra aproximación, se han integrado las fases de amplificación e hibridación en una única etapa, simplificando aún más el proceso analítico. Para ello, la amplificación isoterma por RPA se realiza en fase sólida sobre la superficie del disco en diferentes formatos: gota, cámaras microfluídicas o microreactores. En los dos primeros formatos, las reacciones tienen lugar en la superficie del DVD y la medición se realiza registrando la intensidad del haz láser del lector reflejado, mientras que en el tercer caso la reacción se lleva a cabo en micropocillos integrados en la estructura del DVD y la lectura se realiza midiendo la intensidad de la señal transmitida. Finalmente, se ha desarrollado una metodología para monitorizar la síntesis de ADN en tiempo real, integrando así las etapas de amplificación y cuantificación. Para ello, se emplea la reacción de amplificación isoterma mediada por bucle (LAMP), registrando secuencialmente el avance de la reacción mediante cambios turbidimétricos o colorimétricos en el medio de reacción. De este modo, se relaciona el perfil de cada ensayo con el número de copias de cada gen diana, permitiendo así su cuantificación. Para cada metodología se han establecido las propiedades analíticas, y los resultados obtenidos han sido validados por comparación con técnicas de referencia y mediante el empleo de muestras certificadas. Como prueba de concepto, los diferentes desarrollos se han aplicado a la detección y determinación de la presencia de alérgenos (avellana, cacahuete, soja, tomate y maíz), organismos modificados genéticamente (p35S, tNOS y Bt-11), bacterias patógenas (Salmonella spp., Cronobacter spp. y Campylobacter spp.) y hongos (Fusariu

[CA] La seguretat alimentària està garantida quan es disposa d'aliments suficients, nutritius i innocus. Esta garantia, a més, ha de complir-se al llarg de tot el procés productiu, el que es coneix com a "seguretat de la granja a la taula". Naix així una nova forma d'abordar el problema, amb un enfocament global i un tractament integral. Per a afrontar este repte, les tècniques moleculars basades en la utilització d'àcids nucleics són, actualment, usades en l'anàlisi de certes amenaces alimentàries, com per exemple, la detecció d'al·lèrgens, microorganismes, organismes genèticament modificats (OGM), o l'autentificació de determinades espècies. No obstant això, molts dels mètodes en ús presenten limitacions, ja que són costosos, complicats, i requerixen personal i equipament especialitzat. La tecnologia de biosensors és una aproximació adequada, ja que proporciona resultats fiables de manera senzilla i ràpida, i amb capacitats afegides com portabilitat i automatització per a dur a terme els assajos directament en punts de control (POC). Esta tesi s'ha centrat en el desenvolupament d'un sistema biosensor, basat en la tecnologia de disc compacte, per a la detecció d'àcids nucleics en aplicacions de seguretat alimentària adaptable a POC. Les investigacions dutes a terme han permés obtindre nous coneixements en tecnologies gèniques, podent efectuar aportacions metodològiques d'interés caracteritzades per la seua miniaturització, integració i automatització. En este sentit, una part de la investigació aborda la simplificació de l'etapa d'amplificació de l'ADN diana, eludint el termociclat per mitjà de l'utilització de tècniques alternatives a la reacció en cadena de la polimerasa (PCR). Per a això, s'han estudiat dos tècniques d'amplificació isoterma, l'amplificació per recombinasa polimerasa (RPA) i l'amplificació per desplaçament múltiple (MDA). La detecció es du a terme per mitjà d'assajos d'hibridació amb sondes d'ADN immobilitzades en format micromatriu sobre la superfície de policarbonat d'un DVD. A més, l'amplificació per RPA s'ha combinat amb la detecció per mitjà d'inmunoassaig ezimátic (ELISA) per a la determinació simultània de múltiples anàlits. En una altra aproximació, s'han integrat les fases d'amplificació i hibridació en una única etapa, simplificant encara més el procés analític. Per a això, l'amplificació isoterma per RPA es realitza en fase sòlida sobre la superfície del disc en diferents formats: gota, cambres microfluídicas o microreactors. En els dos primers formats, les reaccions tenen lloc en la superfície del DVD i el mesurament es realitza registrant la intensitat del feix làser del lector reflectit, mentres que en el tercer cas la reacció es du a terme en micropouets integrats en l'estructura del DVD i la lectura es realitza mesurant la intensitat del senyal transmesa. Finalment, s'ha desenvolupat una metodologia per a monitoritzar la síntesi d'ADN en temps real, integrant així les etapes d'amplificació i quantificació. Per a això, s'utilitza la reacció d'amplificació isoterma mitjançada per bucle (LAMP), registrant sequencialment l'avanç de la reacció per mitjà de canvis turbidimétrics o colorimétrics en la reacció. D'esta manera, es relaciona el perfil de cada assaig amb el nombre de còpies de cada gen diana, permetent així la seua quantificació. Per a cada metodologia s'han establit les propietats analítiques i els resultats obtinguts han sigut validats per comparació amb tècniques de referència i per mitjà de l'utilització de mostres certificades. Com a prova de concepte, els diferents desenvolupaments s'han aplicat a la detección i determinació de la presència de al¿lèrgens (avellana, cacauet, soja, tomata i dacsa), organismes modificats genèticament (p35S, tNOS i Bt-11), bacteris patògens (Salmonella spp., Cronobacter spp. i Campylobacter spp.), fongs (Fusarium spp.), així com en la identific