Treating boar sperm with cholesterol-loaded cyclodextrins or cyclodextrins prior to cryopreservation: effects on post-thaw in vitro sperm quality of sperm cryopreserved in different freezing extenders

Abstract

[EN] Cryopreserved boar sperm is not used extensively for artificial insemination due to poor fertility rates of the sperm after freezing and thawing. The sperm membrane is damaged when cooled from body temperature to 5 ºC (cold shock), as well as during the freeze-thaw process. Increasing the cholesterol content of boar sperm membranes could increase their post-thaw survival, similarly to other species that are cold shock sensitive. Cholesterol can be easily added to sperm membranes using cholesterol-loaded cyclodextrins (CLC). Treating sperm from different species susceptible to cold-shock with CLC before cryopreservation improves sperm cryosurvival. Egg yolk and glycerol are common constituents of extenders used for boar sperm cryopreservation. However, conventional freezing extenders could not be the appropriate for CLC-treated sperm. The aim of this Thesis is to evaluate cryosurvival of CLC or cyclodextrin-treated boar sperm in three different conditions: using conventional freezing extenders, using extenders with alternative concentrations of glycerol and egg yolk and using amides as cryoprotectants. CLC or methyl- ß-cyclodextrin treatment (1 mg/120 x 106 sperm) prior to cryopreservation using a conventional freezing extenders provided either slight or no benefit, respectively, to post-thaw sperm plasma membrane integrity (+ 8%; P < 0.05) and motility (P > 0.05). In addition, sperm from both, good and poor freezers, responded similarly to CLC treatment (P > 0.05). Reduction in egg yolk concentration from 20 to 10% was detrimental for post-thaw sperm viability, even in semen treated with CLC (- 12%; P < 0.05). On the other hand, it was observed that traditional concentration of glycerol (3%) was not the appropriate to freeze CLC-treated sperm (- 13% viable sperm compared to control; P < 0.05). Thus, CLC-treated sperm showed a higher tolerance (+ 13 % sperm viability; P < 0.05) to high glycerol concentrations (5%) than non-treated sperm. Regarding the efficacy of amides as cryoprotectants, three of the amides (lactamide, acetamide and formamide) produced deleterious effects in fresh boar sperm (P < 0.05). The other amides (methylformamide, dimethylacetamide and dimethylformamide) efficiently improved post-thaw sperm viability (+ 5 to 15 %; P < 0.05) but negatively affected the sperm motility (- 11 to 16% total motile sperm; P < 0.05) and the sperm fertilizing ability in vitro (dimethylformamide: - 64 % penetration rate; P < 0.05), irrespective of the sperm treatment. On the other hand, CLC-treated samples showed better in vitro fertilizing ability than control samples when glycerol was used as cryoprotectant (+ 2 penetrated spermatozoa/oocyte; P < 0.05). The results obtained in this Thesis suggest that conventional freezing protocols should be optimized for CLC-treated boar sperm in order to obtain the benefit of CLC treatment observed in other species sensitive to cold shock.

[ES] Las inseminaciones artificiales en la especie porcina se realizan habitualmente con semen refrigerado, debido a las bajas tasas de fertilidad obtenidas con el semen congelado-descongelado. La membrana del espermatozoide sufre importantes daños cuando es sometida a la fase de enfriamiento desde la temperatura corporal hasta alcanzar los 5 ºC (choque térmico), así como durante el proceso de congelación y descongelación. El aumento del contenido de colesterol en las membranas de los espermatozoides de cerdo podría mejorar su supervivencia tras la descongelación, como sucede en otras especies sensibles al choque térmico. Este incremento en la cantidad de colesterol se puede realizar fácilmente utilizando ciclodextrinas saturadas de colesterol (CLC). El tratamiento con CLC de espermatozoides de varias especies susceptibles al choque térmico antes de la congelación ha conseguido mejorar su supervivencia tras la descongelación. En los protocolos convencionales de congelación de semen porcino se utilizan habitualmente diluyentes de congelación compuestos por yema de huevo y glicerol, sin embargo, puede que estos diluyentes de congelación convencionales no sean los más apropiados para congelar espermatozoides tratados con CLC. El objetivo de esta Tesis es evaluar la supervivencia a la congelación de los espermatozoides porcinos tratados con CLC o ciclodextrinas utilizando diluyentes de congelación convencionales, utilizando concentraciones alternativas tanto de yema de huevo como de glicerol o utilizando amidas en lugar de glicerol como crioprotectores Utilizando diluyentes convencionales, el tratamiento con 1mg de CLC o de metil-ß-ciclodextrina/120 millones de espermatozoides previamente a la congelación proporcionó una leve mejora de la integridad de la membrana plasmática espermática (+ 8%; P < 0,05) y ningún beneficio sobre la movilidad espermática (P > 0,05). Además, la respuesta al tratamiento con CLC fue similar independientemente de si los espermatozoides procedían de verracos buenos o malos congeladores (P > 0,05). Una reducción de la concentración de yema de huevo de un 20 a un 10% fue perjudicial para la supervivencia de los espermatozoides tras la descongelación, incluidos aquellos que habían sido tratados previamente con CLC (- 12% espermatozoides vivos; P < 0,05). Por otro lado, observamos que las concentraciones de glicerol utilizadas habitualmente (3%) no son las más apropiadas para congelar espermatozoides tratados con CLC (- 13 % viabilidad espermática comparando con las muestras control; P < 0,05), ya que éstos mostraron una mayor tolerancia (+ 13 % espermatozoides vivos; P < 0,05) que las muestras control a las concentraciones de glicerol más altas (5%). Con respecto a la eficacia de las amidas como crioprotectores para semen porcino, tres de las amidas (lactamida, acetamida y formamida) produjeron efectos perjudiciales durante su incubación con semen fresco (P < 0,05). El resto de amidas evaluadas (metilformamida, dimetilacetamida y dimetilformamida) mejoraron eficientemente la viabilidad espermática tras la congelación (+ 5 a 15 %; P < 0,05), sin embargo, afectaron negativamente tanto la movilidad espermática (- 11 a 16% móviles totales; P < 0,05) como la capacidad de fecundación in vitro (dimetilformamida: - 64 % en la tasa de penetración; P < 0,05), independientemente de si el semen fue tratado con CLC o no. Por otro lado, las muestras tratadas con CLC mostraron mejor capacidad de fecundación in vitro que las muestras control cuando se utilizó el glicerol como crioprotector (+ 2 espermatozoides penetrados/ovocito; P < 0,05). Los resultados obtenidos en esta Tesis sugieren que sería necesaria la adecuación de los protocolos de congelación convencionales para congelar semen porcino tratado con CLC con el propósito de alcanzar los claros beneficios obtenidos con dicho tratamiento cuando ha sido evaluado en otras especies sensibles al choque térmico.

[CA] Les inseminacions artificials en l'espècie porcina es realitzen habitualment amb semen refrigerat, a causa de les baixes taxes de fertilitat obtingudes amb el semen congelat-descongelat. La membrana de l'espermatozoide pateix importants danys quan és sotmesa a la fase de refredament des de la temperatura corporal fins a arribar als 5 ºC (xoc tèrmic), així com durant el procés de congelació i descongelació. L'augment del contingut de colesterol a les membranes dels espermatozoides de porc podria millorar la seva supervivència després de la descongelació, com succeeix en altres espècies sensibles al xoc tèrmic. Aquest increment en la quantitat de colesterol es pot realitzar fàcilment utilitzant ciclodextrines saturades de colesterol (CLC). El tractament amb CLC d'espermatozoides de diverses espècies susceptibles al xoc tèrmic abans de la congelació ha aconseguit millorar la seva supervivència després de la descongelació. En els protocols convencionals de congelació de semen porcí s'utilitzen habitualment diluents de congelació compostos per rovell d'ou i glicerol, però, pot ser que aquests diluents de congelació convencionals no siguin els més apropiats per congelar espermatozoides tractats amb CLC. L'objectiu d'aquesta Tesi és avaluar la supervivència a la congelació dels espermatozoides porcins tractats amb CLC o ciclodextrines utilitzant diluents de congelació convencionals, utilitzant concentracions alternatives tant de rovell d'ou com de glicerol o utilitzant amides en lloc de glicerol com crioprotectors Utilitzant diluents convencionals, el tractament amb 1 mg de CLC o de metil-ß-ciclodextrina / 120 milions d'espermatozoides prèviament a la congelació va proporcionar una lleu millora de la integritat de la membrana plasmàtica espermàtica (+ 8%; P <0,05) i cap benefici sobre la mobilitat espermàtica (P> 0,05). A més, la resposta al tractament amb CLC va ser similar independentment de si els espermatozoides procedien de verros bons o dolents congeladors (P> 0,05). Una reducció de la concentració de rovell d'ou d'un 20 a un 10% va ser perjudicial per a la supervivència dels espermatozoides després de la descongelació, inclosos aquells que havien estat tractats prèviament amb CLC (- el 12% espermatozoides vius; P <0,05) . D'altra banda, observem que les concentracions de glicerol utilitzades habitualment (3%) no són les més apropiades per congelar espermatozoides tractats amb CLC (- 13% viabilitat espermàtica comparant amb les mostres control; P <0,05), ja que aquests van mostrar una major tolerància (+ 13% espermatozoides vius; P <0,05) que les mostres control a les concentracions de glicerol més altes (5%). Pel que fa a l'eficàcia de les amides com crioprotectors per semen porcí, tres de les amides (lactamida, acetamida i formamida) van produir efectes perjudicials durant la seva incubació amb semen fresc (P <0,05). La resta de amides avaluades (metilformamida, dimetilacetamida i dimetilformamida) van millorar eficientment la viabilitat espermàtica després de la congelació (+ 5 a 15%, P <0,05), però, van afectar negativament tant la mobilitat espermàtica (- 11 a 16% mòbils totals; P <0,05) com la capacitat de fecundació in vitro (dimetilformamida: - el 64% en la taxa de penetració; P <0,05), independentment de si el semen va ser tractat amb CLC o no. D'altra banda, les mostres tractades amb CLC van mostrar millor capacitat de fecundació in vitro que les mostres control quan es va utilitzar el glicerol com crioprotector (+ 2 espermatozous penetrats / oòcit; P <0,05). Els resultats obtinguts en aquesta Tesi suggereixen que seria necessària l'adequació dels protocols de congelació convencionals per congelar semen porcí tractat amb CLC amb el propòsit d'assolir els clars beneficis obtinguts amb el tractament quan ha estat avaluat en altres espècies sensibles al xoc tèrmic.