Identificación de nuevos genes implicados en la tolerancia al estrés ácido intracelular en Arabidopsis

Abstract

[EN] All the species along the evolution have developed diferents mechanisms to resist any changes in their environment. But the plants, to be sessile organisms , have had to develop many more tools of defense or adaptation that other beings able to flee in search of more favorable conditions. Any variation in their habitat, especially the abrupt ones or prolonged in time can generate to the plants a stress state either by the attack of pathogens , extreme environmental conditions , lack of water or minerals, contaminants , etc. In the present work, we study wich are the mechanisms used by the plants to resist the intracellular acid stress, produced when the cells and its compartiments have levels of pH 4 outside the normal range that hamper maintain homeostasis. This imbalance creates a whole series of disturbances at the biochemical level within cells , which adversely affects a large number of processes required for proper operation of the plants. To find new genes involved in pH homeostasis regulation we have used two approaches in the model plant Arabidopsis thaliana: In the first place, we have analyzed the relative expression levels of candidate genes in three lines that were mutagenized by activation tagging by the C.Somerville and W.Sheible researchers. This lines called Ps84, S293, S787 has been exanimate previously and are resistant to intracellular acid stress. The possible genes affected by this mutation had been identified too in previous studies like traces of mutants and co-segregation analysis, Southern blot and plasmid rescue. After gathering this information, we proceeded to the study of gene expression by RT-qPCR technique. Knowing the insertion point of the TDNA in these lines, and the scope (≈10kb) of transcriptional activators (4x35s) containing, it allows to design adjacent genes primers that may be under his influence and analyze the transcript levels generated. Therefore, the results of the RT-qPCR allow us to observe possible changes in gene expression of the candidate genes, and thus allows us to relate the tolerance phenotype to one or more genes and their functions. Secondly, we used 3 mutant lines called S446, S151, S263 in the same previous collection, which previous work has shown that cosegregated with resistance acetic acid phenotype. In this case, it is intended to locate the position and orientation of the T-DNA insertion in the genome that cause resistance phenotype. For this we have used the technique of plasmid rescue. We used the Escherichia coli strain XL1-Blue MRF' to transform E. coli by electroporation and DH5a strain for transformation by heat shock. Once we obtain colonies by transformation we make an extraction of his plasmids and send to sequencing to obtain the sequence of the genomic fragment that is next to the T-DNA, that will indicate us the insertion zone. When we have identified the zone we could point the possible genes affected by the four copies of the transcriptional activator 35S presents in the T-DNA inserted (able to influence around 10Kb distance). Future exhaustive analysis may could related some of them with the intracellular stress acid tolerance.

[ES] Todos los seres vivos, a lo largo de la evolución, han desarrollado diferentes mecanismos para hacer frente a los cambios de su entorno. Las plantas por su parte, al ser organismos sésiles, han tenido que desarrollar muchas más herramientas de defensa o adaptación que otros seres capaces de huir en busca de condiciones más favorables. Estas variaciones en su hábitat, especialmente si son bruscas o se prolongan en el tiempo, pueden generar a la planta un estado de estrés, bien por el ataque de patógenos, condiciones ambientales extremas, falta de recursos hídricos o minerales, presencia de contaminantes, etc. En el presente trabajo, se estudian los mecanismos utilizados por las plantas para hacer frente al estrés ácido intracelular que se produce cuando las células y sus compartimentos presentan niveles de pH fuera de su rango normal, impidiéndoles mantener la homeostasis. Este desajuste genera todo un conjunto de perturbaciones a nivel bioquímico dentro de las células, que influye negativamente en un gran número de procesos necesarios para el correcto funcionamiento de las plantas. Para encontrar nuevos genes reguladores de la homeostasis de pH se han realizado dos abordajes en la planta modelo Arabidopsis thaliana: En primer lugar, se han analizado los niveles de expresión relativa de los posibles genes candidatos de tres líneas mutagenizadas mediante "activation tagging" por los investigadores C.Somerville y W.Sheible, y que se ha observado son resistentes al estrés ácido intracelular (PS84, S293, S787). Los posibles genes afectados por esta mutación se habían identificado en trabajos previos, donde se habían realizado rastreos de mutantes y análisis de cosegregación, así como Southern blot y rescate plasmídico. Una vez recopilada esta información, se ha procedido al estudio de su expresión génica mediante la técnica RT-qPCR. El hecho de conocer el punto de inserción del T-DNA en estas líneas, así como el alcance (≈10kb) de los activadores transcripcionales (4x35s) que contiene, permite diseñar cebadores de los genes adyacentes que puedan estar bajo su influencia y analizar los niveles de transcritos generados. Por tanto, los resultados obtenidos de la RT-qPCR nos permiten observar posibles variaciones de la expresión génica de los genes candidatos, y por lo tanto, permite relacionar dicho fenotipo de tolerancia con uno o varios genes y sus funciones. En segundo lugar, se parte de 4 líneas mutantes (S446, S263 y S96) de la misma colección anterior, que por trabajos anteriores se ha observado que cosegregaban con el fenotipo de resistencia a ácido acético. En este caso, se pretende localizar en el genoma la posición y la orientación de la inserción del T-DNA causante de dicha resistencia resistencia. Para ello se ha empleado la técnica del rescate plasmídico. Se ha utilizado la cepa de Escherichia coli XL1-Blue MRF' para transformar E. coli por electroporación y la cepa DH5α para su transformación por choque térmico. Una vez obtenidas colonias en las trasformaciones se extraen los plásmidos que contienen y se mandan a secuenciar para obtener la secuencia del fragmento genómico que está al lado del T-DNA, que nos indicará la zona de inserción. Una vez identificada, puesto que este T-DNA presenta 4 copias del activador transcripcional 35S (con capacidad de influenciar genes que estén a una distancia alrededor de las 10kb) podemos señalar los posibles genes afectados por la inserción, a la espera de que futuros análisis más concretos puedan relacionar alguno de ellos con la resistencia frente estrés ácido intracelular.