Optimización de la Técnica de Agroinfiltración para la producción de proteínas en Nicotiana benthamiana

Abstract

[ES] Las plantas son consideradas un buen sistema para la expresión lo que permite usarlas como biofactorías. El uso de plantas como biofactorías tiene importantes ventajas en comparación con otras técnicas utilizadas, como son: - Menor coste de producción - Obtención de proteínas funcionales libres de contaminaciones de patógenos de animales - Seguridad, por no ser la planta transformada de forma estable - Facilidad en la purificación de las proteínas obtenidas - Fácil escalabilidad de la producción

Actualmente el ¿molecular pharming¿ puede considerarse una opción para producir fármacos para diferentes enfermedades, para producir vacunas o proteínas biológicas con valor añadido.

Al hilo de las múltiples ventajas el Trabajo Fin de Máster propuesto trata de, alterando diferentes variables que puedan influir en la expresión y producción de proteínas en plantas, aumentar la eficiencia, con el fin de lograr una escalabilidad de alta producción del proceso.

Para el uso de las plantas como biofactoría se usa la expresión transitoria, una estrategia más rápida que la transformación nuclear de la planta y muy eficiente para la producción de proteínas recombinantes. La expresión transitoria requiere de la utilización de vectores virales y de la técnica llamada agroinfiltración.

La agroinfiltracion consiste en la infiltración de cepas de Agrobacterium utilizando un plásmido que contiene los genes que se quieren expresar en la planta lo que permite que el transgén se introduzca en el núcleo celular, pero no se integra en el material genético de la planta. Por otra parte, el vector vírico permite la infección rápida de la planta. Generalmente la agroinfiltración se lleva a cabo haciendo el vacío para que la solución de agroinfiltración penetre de forma rápida en el tejido vegetal. En esta propuesta de Trabajo Fin de Máster se utilizan otras técnicas para la expresión transitoria mediada por Agrobacterium como son el spray o la inmersión para comprobar la eficiencia de la expresión transitoria sin necesidad de hacer el vacío. Por otra parte, obtener buenos resultados en términos de expresión y producción requiere de unas determinadas condiciones de OD (densidad óptica bacteriana), el transcurso de un determinado periodo de tiempo, determinadas concentraciones del surfactante utilizado, etc.

En esta propuesta de Trabajo Fin de Máster se utilizan diferentes herramientas alternativas a la agroinfiltración clásica, como pulverización con diferentes instrumentos, surfactantes o inmersión (sin hacer vacío). Se prueba la eficiencia de la expresión transitoria con diferentes OD, para comprobar a qué OD la concentración es óptima, con la mínima inversión de producto. Se utilizan diferentes concentraciones de un producto surfactante (para facilitar que el medio penetre en el tejido de la planta), así como diferentes marcas del producto, para obtener, de igual forma que con la OD, las concentraciones óptimas para una buena eficiencia en la expresión. Por otra parte, se ensaya la utilidad de sumergir una segunda vez las plantas ya sumergidas, para aumentar la expresión de la proteína de interés en las mismas.

El objetivo es conocer las concentraciones óptimas de OD, surfactante así como el tiempo. Esto permite poder utilizar la cantidad justa de producto sin despilfarrar en cultivos bacterianos, lo que supone el ahorro de medios de cultivo, antibióticos, electricidad,¿así como de surfactante y otros recursos utilizados.

Por otro lado, para medir la expresión, se ha utilizado la fotografía, para ello se desarrollarán protocolos de toma de imágenes y protocolos de conteo de área vegetal infectada con programas de amplio uso como son Photoshop, Image j o Fiji.