Protein-based injectable hydrogels towards the regeneration of articular cartilage

Abstract

[EN] Articular cartilage is a tissue with low capacity for self-restoration due to its avascularity and low cell population. It is located on the surface of the subchondral bone covering the diarthrodial joints. Degeneration of articular cartilage can appear in athletes, in people with genetic degenerative processes (osteoarthritis or rheumatoid arthritis) or due to a trauma; what produces pain, difficulties in mobility and progressive degeneration that finally leads to joint failure. Self-restoration is only produced when the defect reaches the subchondral bone and bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) invade the defect. However, this new formed tissue is a fibrocartilaginous type cartilage and no a hyaline cartilage, which finally leads to degeneration. Transplantation of autologous chondrocytes has been proposed to regenerate articular cartilage but this therapy fails mainly to the absence of a material support (scaffold) for the adequate stimulation of cells. Matrix-induced autologous chondrocyte implantation uses a collagen hydrogel as scaffold for chondrocytes; however, it does not have the adequate mechanical properties, does not provide the biological cues for cells and regenerated tissue is not articular cartilage but fibrocartilage. Different approaches have been done until now in order to obtain a scaffold that mimics better articular cartilage properties and composition. Hydrogels are a good option as they retain high amounts of water, in a similar way to the natural tissue, and can closely mimic the composition of natural tissue by the combination of natural derived hydrogels. Their three-dimensionality plays a critical role in articular cartilage tissue engineering to maintain chondrocyte function, since monolayer culture of chondrocytes makes them dedifferentiate towards a fibroblast-like phenotype secreting fibrocartilage. Recently, injectable hydrogels have attracted attention for the tissue engineering of articular cartilage due to their ability to encapsulate cells, injectability in the injury with minimal invasive surgeries and adaptability to the shape of the defect. Following this new approach we aimed at synthesizing two new families of injectable hydrogels based on the natural protein gelatin for the tissue engineering of articular cartilage. The first series of materials consisted on the combination of injectable gelatin with loose reinforcing polymeric microfibers to obtain injectable composites with improved mechanical properties. Our results demonstrate that there is an influence of the shape and distribution of the fibers in the mechanical properties of the composite. More importantly bad fiber-matrix interaction is not able to reinforce the hydrogel. Due to this, our composites were optimized by improving matrix-fiber interaction through a hydrophilic grafting onto the microfibers, with very successful results. The second series of materials were inspired in the extracellular matrix of articular cartilage and consisted of injectable mixtures of gelatin and hyaluronic acid. Gelatin molecules in the mixtures provided integrin adhesion sites to cells, and hyaluronic acid increased the mechanical properties of gelatin. This combination demonstrated ability for the differentiation of MSCs towards the chondrocytic lineage and makes these materials very good candidates for the regeneration of articular cartilage. The last part of this thesis is dedicated to the synthesis of a non-biodegradable material with mechanical properties, swelling and permeability similar to cartilage. This material intends to be used as a platform in a bioreactor in which the typical loads of the joint are simulated, so that the hydrogels or scaffolds would fit in the recesses in the platform. The function of the platform is to simulate the effect of the surrounding tissue on the scaffold after implantation and could reduce animal experimentation by simulating in vivo conditions.

[ES] El cartílago articular es un tejido con baja capacidad de auto-reparación debida a su avascularidad y baja población celular. Se encuentra en la superficie del hueso subcondral cubriendo las articulaciones. La degeneración del cartílago articular puede aparecer en atletas, en personas con procesos genéticos degenerativos o debido a un trauma; lo que produce dolor, dificultades en la movilidad y degeneración progresiva que lleva al fallo de la articulación. La auto-reparación sólo se produce cuando el defecto alcanza el hueso subcondral y las células madre (MSCs) de la médula ósea invaden el defecto. Sin embargo, este nuevo tejido es un cartílago de tipo fibrocartilaginoso y no un cartílago hialino, el cual finalmente lleva a la degeneración. El trasplante de condrocitos autólogos ha sido propuesto para regenerar el cartílago articular pero esta terapia falla principalmente por la ausencia de un material soporte (scaffold) que estimule adecuadamente a las células. El implante de condrocitos autólogos mediante un hidrogel de colágeno no tiene las propiedades mecánicas apropiadas, no proporciona las señales biológicas a las células y el tejido regenerado no es cartílago articular sino fibrocartílago. Se han realizado diferentes enfoques para obtener un scaffold que mimetice mejor las propiedades y la composición del cartílago articular. Los hidrogeles son una buena opción ya que retienen elevadas cantidades de agua, de forma similar al tejido natural, y pueden imitar de cerca la composición del tejido natural mediante la combinación de derivados de hidrogeles naturales. Su tridimensionalidad juega un papel crítico para mantener la función de los condrocitos, ya que el cultivo en monocapa de los condrocitos hace que desdiferencien hacia un fenotipo similar al fibroblasto secretando fibrocartílago. Los hidrogeles inyectables han acaparado la atención en la ingeniería tisular de cartílago articular debido a su capacidad para encapsular células, su inyectabilidad en el daño con cirugías mínimamente invasivas y su adaptabilidad a la forma del defecto. Siguiendo este nuevo enfoque hemos sintetizado dos nuevas familias de hidrogeles inyectables basados en la proteína natural gelatina para la ingeniería tisular del cartílago articular. La primera serie de materiales combina una gelatina inyectable con microfibras poliméricas sueltas de refuerzo para obtener composites inyectables con propiedades mecánicas mejoradas. Nuestros resultados demuestran que hay una influencia de la forma y la distribución de las fibras en las propiedades mecánicas del composite. Además, la mala interacción entre las fibras y la matriz no es capaz de reforzar el hidrogel. Debido a esto, nuestros composites han sido optimizados mediante la mejora de la interacción fibra-matriz a través de un injerto hidrófilo sobre las microfibras, con resultados muy exitosos. La segunda serie de materiales se ha inspirado en la matriz extracelular del cartílago articular y ha consistido en mezclas inyectables de gelatina y ácido hialurónico. Las moléculas de gelatina proporcionan los dominios de adhesión mediante integrinas a las células, y el ácido hialurónico aumenta las propiedades mecánicas de la gelatina. Esta combinación ha demostrado la habilidad para la diferenciación de MSCs hacia el linaje condrocítico y convierte a estos materiales en buenos candidatos para la regeneración del cartílago articular. La última parte de esta tesis se dedica a la síntesis de un material no biodegradable con propiedades mecánicas, hinchado y permeabilidad similar al cartílago. Este material pretende ser empleado como plataforma en un biorreactor en el que se simulan las cargas típicas de las articulaciones, de forma que los scaffolds encajarían en los huecos de la plataforma. Su función es simular el efecto del tejido circundante en el scaffold después de su implantación y podría reducir la experimentación anim

[CA] El cartílag articular es un teixit amb baixa capacitat d'auto-reparació deguda a la seua avascularitat i baixa població cel·lular. Es troba en la superfície de l'ós subcondral cobrint les articulacions. La degeneració del cartílag articular pot aparèixer en atletes, en persones amb processos genètics degeneratius o degut a un trauma; produeix dolor, dificultats a la mobilitat i degeneració progressiva que finalment porta a la fallida de l'articulació. L'auto-reparació es produeix quan el defecte arriba fins a l'ós subcondral i les cèl·lules mare (MSCs) de la medul·la òssia envaeixen el defecte. No obstant això, aquest nou teixit format es un cartílag de tipus fibrocartilaginós i no un cartílag hialí, el qual finalment porta a la degeneració. El transplantament de condròcits autòlegs ha sigut proposat per a regenerar el cartílag articular però aquesta teràpia falla principalment per la absència d'un material de suport (scaffold) que estimuli adequadament a les cèl·lules. L'implant de condròcits autòlegs en un hidrogel de col·lagen per als condròcits no té les propietats mecàniques apropiades, no proporciona les senyals biològiques a les cèl·lules i el teixit regenerat no és cartílag articular sinó fibrocartílag. Diferents enfocs han sigut realitzats fins ara per a obtenir un scaffold que mimetitzi millor les propietats i la composició del cartílag articular. Els hidrogels son una bona opció ja que retenen elevades quantitats d'aigua, de forma similar al teixit natural, i poden imitar acuradament la composició del teixit natural mitjançant la combinació d'hidrogels naturals. La seua tridimensionalitat juga un paper crític per a mantenir la funció dels condròcits, ja que el cultiu en monocapa dels condròcits fa que aquests desdiferencien cap a un fenotip similar al fibroblàstic secretant fibrocartílag. Recentment, els hidrogels injectables han acaparat l'atenció en l' enginyeria tissular de cartílag articular degut a la seua capacitat per a encapsular cèl·lules, la seua injectabilitat en el dany amb cirurgies mínimament invasives i la seua adaptabilitat a la forma del defecte. Seguint aquesta nova aproximació hem sintetitzat dues noves famílies d'hidrogels injectables basats en la proteïna natural gelatina per a l'enginyeria tissular del cartílag articular. La primera sèrie de materials combina una gelatina injectable amb microfibres polimèriques soltes de reforç per a obtenir compòsits injectables amb propietats mecàniques millorades. Els nostres resultats demostren que hi ha una influència de la forma i la distribució de les fibres en les propietats mecàniques del compòsit. Més importantment, la mala interacció entre les fibres i la matriu no és capaç de reforçar l'hidrogel. Degut a això, els nostres compòsits han segut optimitzats mitjançant la millora de la interacció fibra-matriu a traves d'un empelt hidròfil sobre les fibres, amb resultats molt exitosos. La segona sèrie de materials està inspirada en la matriu extracel·lular del cartílag articular i ha consistit en mescles injectables de gelatina i àcid hialurònic. Les molècules de gelatina proporcionen els dominis d'adhesió mitjançant integrines a les cèl·lules, i l'àcid hialurònic augmenta les propietats mecàniques de la gelatina. Esta combinació ha demostrat l'habilitat per a la diferenciació de MSCs cap al llinatge condrocític i converteix a aquests materials en bons candidats per a la regeneració del cartílag articular. L'última part d'aquesta tesi és dedicada a la síntesi d'un material no biodegradable amb propietats mecàniques, inflat i permeabilitat similar al cartílag. Aquest material pretén ser utilitzat com a plataforma a un bioreactor que simula les cargues típiques de les articulacions, de manera que els hidrogels o scaffolds encaixarien als buits de la plataforma. La seua funció es simular l'efecte del teixit circumdant al scaffold després d