Determinación del mejor método de ajuste y optimización de la densidad celular en cultivo de microsporas de berenjena

Abstract

[EN] In isolated microspores cultures, cellular density is a key factor in the response to androgenesis induction. Traditionally, counting chambers have been used to adjust the initial density of microspores, but other methods could provide more reliable, accurate and repetitive measures. In the present study, six different methods have been evaluated for cellular counting: The Neubauer chamber, a field counting method, an automatic counter, and flow cytometry to detect the autofluorescence of unstained microspores, the fluorescence of propidium iodide-stained microspores, and the side scattered light (SSC) from microspores irradiated with a laser beam. Once concluded that SSC provided the best results, it was used to adjust the initial density of eggplant microspores. Several essays were performed to optimize the protocol of eggplant microspores culture. First, the response to androgenesis induction of two plate sizes (6 and 3 cm-wide, 3 and 1 ml volume, respectively) was compared. Results suggested that there were no differences between both sizes. Second, the response of different microspores densities was compared. The densities were: 50.000, 200.000, 500.000 (used up to now), 1.000.000, and 2.000.000 microspores/ml. The best results were obtained using 200.000 microspores/ml. In addition, our results suggested that there is a minimum density threshold below which microspores are not able to change their pathway to embriogenesis, and there is a maximum density threshold above which cultures become inviable because of endogenous contamination of the microspore inocules.

[ES] En el cultivo de microsporas aisladas, la densidad celular es un factor que influye en la respuesta a la inducción de la androgénesis. Tradicionalmente, se han utilizado las cámaras de recuento para ajustar la densidad inicial de microsporas, pero existen otros métodos que nos pueden dar medidas más fiables, precisas y repetibles. En el presente estudio se evalúan seis métodos de conteo celular: cámara de Neubauer, conteo por campos, contador automático, citometría de flujo para detectar la autofluorescencia de microsporas sin teñir o la fluorescencia y dispersión lateral de la luz de microsporas teñidas con yoduro de propidio. Una vez concluido que el citómetro de flujo es el que da la medida más fiable, se aplicó este método para ajustar la densidad inicial de microsporas en cultivo de berenjena. Se llevaron a cabo ensayos para optimizar el protocolo de cultivo de microsporas en berenjena. En primer lugar, se hizo la comparación entre la respuesta obtenida en placas de 6 cm de diámetro, con 3 ml de medio de cultivo, y la de placas de 3 cm de diámetro, con 1 ml de medio de cultivo, a una densidad de 500.000 microsporas/ml. El resultado fue que el tamaño de placa no tiene efectos significativos en la respuesta a la inducción de la androgénesis. En segundo lugar, se comparó la respuesta de una batería de densidades de microsporas: 50.000, 200.000, 500.000 (usada hasta ahora), 1.000.000, 2.000.000 microsporas/ml, resultando óptima la densidad de 200.000 microsporas/ml. Los resultados de este experimento sugieren que existe una densidad mínima por debajo de la cual las microsporas no desvían su ruta hacia la embriogénesis, y una densidad máxima por encima de la cual los cultivos se hacen inviables por contaminación endógena del tejido de partida.