Generación de líneas T-DNA de tomate (Solanum lycopersicum L.), identificación de mutantes de inserción afectados en caracteres del desarrollo y caracterización de mutantes de fruto partenocárpico

Abstract

[EN] In order to identify the genes controlling developmental traits and abiotic stress tolerance in tomtato, our laboratory is performing an insertion mutagenesis program, in collaboration with the groups of Dr. Rafael Lozano (Almería University) and Dr. Mª Carmen Bolarín (CEBAS-Murcia). This PhD thesis is part of our insertion mutagenesis program and aims to keep deepening in the genetic dissection of relevant traits from an agronomic perspective using the generation and characterization of tomato T-DNA lines. With the goal of increasing the collection of tomato T-DNA lines previously generated in our group, we generated 974 new T-DNA lines. This collection of tomato T-DNA lines was evaluated in the greenhouse in order to detect dominant or semi-dominant mutants altered in vegetative and/or reproductive traits. In particular we paid special attention to mutants with changes in fruit set, since the altered genes in those mutants could play a role in the yield of tomato cultivars. The transition from ovary to a developing fruit (i.e. fruit set), occurs once the flower has reached the anthesis stage, and depends on the pollination and fecundation. However, the fruit development can also happen independently of pollination through a process named parthenocarpy. It is known that the growth regulators, mainly auxins and gibberellins, are involved in both kinds of fruit set processes. Even so, the genetic mechanisms that trigger the transition from ovary to fruit remain largely unknown. Accordingly, tomato mutants can be a valuable tool to shed light on the molecular and genetic basis that promote pollination-dependent or independent fruit set processes. Given the enormous interest raised by parthenocarpy, the work carried out in the context of this PhD thesis has been mainly focused on several seedless fruits mutants. The characterization of those mutants revealed alterations in vegetative plant development (e.g. leaf architecture) and/or reproductive development (e.g. fruit morphology) have been observed, suggesting that changes in endogenous levels of growth regulators (e.g. auxins and gibberellins) are closely related to the parthenocarpic fruit development. According to the histological analysis, most of the mutants showed cytological androsterility, and part of them also displayed deficiencies during the pollen sacs formation, a trait also related to parthenocarpic fruit development. Furthermore, it has been observed an increased fruit set rate in some parthenocarpic mutants leading to a higher fruit production per plant. Some mutants displayed a tight correlation between the alteration in floral whorls or fruit tissues and the expression of the GUS reporter gene included in the T-DNA, suggesting that the gen responsible of the mutant phenotype could be tagged by a T-DNA insert. Finally, the phenotypic, genetic and molecular characterization of the back-cross progeny of the Tom24 mutant suggests that this phenotype could be a consequence of a T-DNA insert which is not transmitted to the offspring due to a lethal effect in both types of gametes (male and female).

[ES] Con el fin de identificar genes que controlan caracteres del desarrollo y tolerancia a estrés abiótico, estamos abordando un programa de mutagénesis insercional en colaboración con los grupos del Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia). Esta Tesis Doctoral se enmarca en el contexto de este programa de mutagénesis insercional y tiene como objetivo central seguir profundizando en la disección genética de caracteres relevantes desde un punto de vista agronómico a través de la generación y caracterización de líneas T-DNA de tomate. Con el objetivo de ampliar la colección que previamente se ha generado en nuestro grupo, se han obtenido 974 líneas T-DNA de tomate y se ha llevado a cabo la evaluación de estas líneas a fin de detectar mutantes dominantes o semidominantes afectados en caracteres vegetativos y/o reproductivos. En particular, la identificación de mutantes con cambios en el cuajado y desarrollo del fruto tiene una enorme relevancia a nivel agronómico dado que los genes alterados en estos mutantes intervienen sobre caracteres que contribuyen a la producción de un cultivar. El proceso de cuajado, es decir, la transición desde el ovario a un fruto en desarrollo, ocurre una vez la flor alcanza el estadio de antesis, y depende del éxito de la polinización y de la fecundación. No obstante, el desarrollo del fruto puede ser independiente de la polinización a través de un proceso denominado partenocarpia. En ambos procesos de cuajado, dependiente e independiente de polinización, están implicadas señales hormonales, especialmente auxinas y giberelinas (GAs). Aún así, la base genética de los mecanismos que desencadenan la transición del ovario a fruto es en gran medida desconocida. En este sentido, la disponibilidad de mutantes de tomate puede ser una herramienta muy valiosa para avanzar en el conocimiento de las bases moleculares y genéticas que promueven el cuajado del fruto dependiente e independiente de polinización. Habida cuenta del interés que suscita la partenocarpia, el trabajo realizado en el contexto de esta Tesis Doctoral se ha centrado en una serie de mutantes que desarrollan frutos sin semillas. La caracterización de estos mutantes ha permitido observar alteraciones en el desarrollo vegetativo (e.g. arquitectura foliar) y/o reproductivo (e.g. morfología del fruto) que sugieren cambios en los niveles endógenos de hormonas (e.g. auxinas y giberelinas) estrechamente vinculadas al desarrollo partenocápico del fruto. El análisis histológico ha indicado que la mayor parte de los mutantes exhiben androesterilidad citológica, y algunos también muestran alteraciones en la formación de los sacos polínicos o el desarrollo de la antera, un carácter que también está vinculado al desarrollo partenocápico del fruto. Por otro lado, se ha comprobado que la mayor tasa de cuajado de algunos mutantes partenocárpicos promueve una mayor producción por planta. En algunos mutantes se ha observado una estrecha relación entre la expresión del delator y la mutación, es decir, la actividad GUS se detecta en los órganos afectados, lo que sugiere que el gen responsable del fenotipo mutante se encuentra etiquetado por un T-DNA. Por último, la caracterización fenotípica, genética y molecular de plantas de la progenie de retrocruce del mutante Tom24 sugiere que el fenotipo se debe a un inserto de T-DNA que no se transmite a la descendencia debido a que provoca letalidad en ambos tipos de gametos (masculinos y femeninos).

[CA] Pel tal d'identificar els gens que controlen caràcters del desenvolupament i tolerància a estrès abiòtic, estem abordant un programa de mutagènesi insercional en col·laboració amb els grups del Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia). Aquesta Tesi Doctoral s'emmarca en el context d'aquest programa de mutagènesi insercional y té l'objectiu central seguir profunditzant en la dissecció genètica de caràcters rellevants des d'un punt de vista agronòmic a través de la generació y caracterització de línies T-DNA de tomaca. Amb l'objectiu d'ampliar la col·lecció que prèviament s'ha generada en el nostre grup, s'han obtingut 974 línies T-DNA de tomaca y s'ha dut a terme l'avaluació d'aquestes línies amb la finalitat de detectar mutants dominants o semidominants afectats en caràcters vegetatius i/o reproductius. En particular, la identificació de mutants amb canvis en el quallat i desenvolupament del fruit té una enorme rellevància a nivell agronòmic atès que els gens alterats en aquests mutants intervenen sobre caràcters que contribueixen a la producció de un cultivar. El procés del quallat, és a dir, la transició des de l'ovari a un fruit en desenvolupament, passa una vegada la flor arriba a l'estadi d'antesi, y depèn de l'èxit de la pol·linització i de la fecundació. No obstant, el desenvolupament del fruit pot ser independent de la pol·linització a través d'un procés denominat partenocàrpia. En ambos processos de quallat, dependent o independent de pol·linització, estan implicats senyals hormonals, especialment auxines i gibberel·lines (GAs). Tot i així, la base genètica dels mecanismes que desencadenen la transició de l'ovari al fruit és en gran mesura desconeguda. En aquest sentit, la disponibilitat de mutants de tomaca pot ser una eina molt valuosa per a avançar en el coneixement de les bases moleculars y genètiques que promouen el quallat del fruit depenent o independent de pol·linització. Tenint en compte de l'interès que suscita la partenocàrpia, el treball realitzat en el context d'aquesta Tesi Doctoral s'ha centrat en una sèrie de mutants que desenvolupen fruits sense llavors. La caracterització d'aquests mutants ha permès observar alteracions en el desenvolupament vegetatiu (e.g. arquitectura foliar) i/o reproductiu (e.g. morfologia del fruit) que suggereixen canvis en els nivells endògens d'hormones (e.g. auxines i gibberel·lines) estretament vinculades al desenvolupament partenocàrpic del fruit. L'anàlisi histològic ha indicat que la major part del mutants exhibeixen androesterilitat citològica, i alguns també mostren alteracions en la formació del sacs pol·linics o el desenvolupament de l'antera, un caràcter que també està vinculat amb es desenvolupament partenocàrpic del fruit. D'altra banda, s'ha comprovat que la major taxa de quallat d'alguns mutants partenocàrpics promou una major producció per planta. En alguns mutants s'ha observat una estreta relació entre l'expressió del delator i la mutació, és a dir, l'activitat GUS es detecta en els òrgans afectats. Això suggereix que el gen responsable del fenotip mutant està etiquetat per un T-DNA. Per últim, la caracterització fenotípica, genètica i molecular de plantes de la progènie de retro-encreuament del mutant Tom24 suggereix que el fenotip és causa de un insert T-DNA que no es transmet a la descendència pel fet que provoca letalitat en ambos tipus de gàmetes (masculins y femenins).