Genotipificación de Mycobacterium tuberculosis complex mediante herramientas moleculares

Abstract

[EN] In the last years, various genotyping techniques were developed for isolation of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) that has demonstrated a high discriminatory power. In this study, after the identification of selected strains at level of species by Genotype MTBC technique, we evaluated the profit of the simplified amplified-fragment Length Polymorphism technique (AFLPs) and the Mycobacterial Interspersed Repetitive Units technique (MIRU-15). A total of 131 mycobacterium tuberculosis isolates were analyzed, 68 isolates were collected in Ecuador, from the Clinical Laboratory of Hospital Alli Causai located in city of Ambato, and the Laboratory of Bacteriology in Carlos Andrade Marín Hospital located in the capital city Quito. The remaining 63 isolates were harvested in Spain and belong to microorganism's collection of Microbiology Services of Consorcio Hospital General Universitario and Hospital Clínico Universitario of the city of Valencia. Among these isolates, 126 were identified by conventional methods such as molecular MTBC, corresponding to 106 patients. The Mycobacterium tuberculosis control strain ATCC 25177 was also identified as such by this method.

The AFLPs technique allowed as to group the strains in twelve patterns (P1 to P8, P10, P12, P13, P14), of which the most prevalent were patterns P1 with 77 (61.1%) and P2 with 27 (21, 4%) isolates, representing 82.5% of the same. These were followed by the pattern P5 with 5 (3.9%) isolates, the patterns P3, P4 and P6 grouped 3 isolates each one (2.4%), the patterns P8 and P12 with 2 isolates (1.6% ) and finally the patterns P7, P10, P13 and P14 with 1 isolated each one (0.8%). The control strain M. tuberculosis ATCC 25177, showed a restriction profile that prevented their inclusion in any of the patterns described. The discriminatory power of the Hunter-Gaston discriminatory index (HGDI) method was 0.5812 against to 0.9843 of the MIRU-15 technique, which grouped 69 strains (54.8%) in 20 clonal complex and 57 unique patterns (45.2%). In the case of Spain, the strains were related mostly to the lineage 4 or Euro-American including: Cammeroon (1.59%), Haarlem (36.51%), S (31.75%), and LAM (19.05%); the lineage 6 or West Africa I (9.53%), the lineage 1 or EIA (1.59%) In the case of Ecuador the strains were related to the lineage 4: Haarlem (42.86%), S (33.33%) and LAM (22.22%) and Beijing lineage 2 (1.59%) from Asia. The MIRU-VNTR Variable-Number Tandem Repeats (15 loci) technique proved to be a stable system, reproducible and high discriminatory power in comparison with AFLPs system, allowing the use of it to conduct prospective population studies with the aim of contributing to the public health programs to control Tuberculosis (TB).

[ES] En los últimos años se han desarrollado diversas técnicas de genotipificación para aislados de Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) que han demostrado tener un alto poder discriminatorio. En este estudio, tras identificación de las cepas seleccionadas al nivel de especie mediante la técnica comercial GenoType MTBC, se ha evaluado la utilidad de la técnica simplificada del Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLPs) y la técnica de Unidades Repetitivas Intercaladas Micobacterianas (MIRU-15). Se analizaron un total de 131 aislados clínicos de los cuales 68 aislados fueron recolectados en Ecuador, provenientes tanto del Laboratorio Clínico del Hospital Alli Causai ubicado en la ciudad de Ambato, provincia de Tungurahua como del Laboratorio de Bacteriología del Hospital Carlos Andrade Marín ubicado en la ciudad capital Quito, provincia de Pichincha. Los 63 aislados restantes fueron recolectados en España y pertenecían colección de microorganismos de los Servicios de Microbiología del Consorcio Hospital General Universitario y Hospital Clínico Universitario de la ciudad de Valencia, provincia de Valencia. De éstos aislados, 126 fueron identificados por métodos convencionales y moleculares como MTBC, correspondientes a 106 pacientes. La cepa control Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 también fue identificada como tal mediante este método. La técnica AFLPs permitió agrupar a las cepas en doce patrones (P1 a P8, P10, P12, P13, P14), de los cuales los más prevalentes fueron los patrones P1 y P2 con 77 (61,1%) y 27 (21,4%) aislados respectivamente, lo que supone el 82,5% del total de los mismos. Le siguieron en frecuencia el patrón P5 con 5 (3,9%) aislados, los patrones P3, P4 y P6 agruparon a 3 aislados cada uno (2,4%), los patrones P8 y P12 con 2 aislados (1,6%) y finalmente los patrones P7, P10, P13 y P14 con 1 aislado cada uno (0,8%). La cepa control M. tuberculosis ATCC 25177, mostró un perfil de restricción que no permitió su inclusión en ninguno de los patrones descritos. El poder discriminatorio del método (HGDI) fue de 0,5812 frente a 0.9843 de la técnica MIRU-15, que agrupó a 69 cepas (54,8%) en 20 complejos clonales y 57 patrones únicos (45,2%). Para el caso de España, las cepas estuvieron relacionadas en su mayoría con el linaje 4 o Euro-Americano que incluye: Cammeroon (1,59%), Haarlem (36,51%), S (31,75%), y LAM (19,05%); el linaje 6 o West Africa I (9,53%), el linaje 1 o EIA (1,59%), Para el caso de Ecuador las cepas estaban relacionadas con el linaje 4: Haarlem (42,86%), S (33,33%), y LAM (22,22%) y el linaje 2 Beijing (1,59%) originario de Asia. La técnica MIRU-VNTR (15 loci) demostró ser un sistema estable, reproducible y con un poder discriminatorio alto en comparación con AFLPs lo que permitiría emplearlo para realizar estudios poblacionales prospectivos con la finalidad de contribuir a los programas de Salud Pública para el control de la Tuberculosis (TB).

[CA] En els últims anys s'han desenvolupat diverses tècniques de genotipificació per aïllats de Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) que han demostrat tenir un alt poder discriminatori. En aquest estudi, després de la identificació de les soques seleccionades al nivell d'espècie mitjançant la tècnica comercial GenoType MTBC, s'ha avaluat la utilitat de la tècnica simplificada del Polimorfisme de longitud de fragments amplificats (AFLPs) i la tècnica d'Unitats repetitives Intercalades micobacterianes (Miru-15). Es van analitzar un total de 131 aïllats clínics dels quals 68 aïllats van ser recollectats a Equador, provinents tant del Laboratori Clínic de l'Hospital Alli Causai situat a la ciutat d'Ambato, província de Tungurahua com del Laboratori de Bacteriologia de l'Hospital Carlos Andrade Marín ubicat a la ciutat cabdal Quito, província de Pichincha. Els 63 aïllats restants van ser recollectats a Espanya i pertanyien a la collecció de microorganismes dels Serveis de Microbiologia del Consorci Hospital General Universitari i Hospital Clínic Universitari de la ciutat de València, província de València. D'aquests aïllats, 126 van ser identificats per mètodes convencionals i moleculars com MTBC, corresponents a 106 pacients. La soca control Mycobacterium tuberculosi ATCC 25177 també va ser identificada com a tal mitjançant aquest mètode. La tècnica AFLPs va permetre agrupar les soques en dotze patrons (P1 a P8, P10, P12, P13, P14), dels quals els més prevalents van ser els patrons P1 i P2 amb 77 (61,1%) i 27 (21, 4%) aïllats respectivament, fet que suposa el 82,5% del total dels mateixos. El van seguir en freqüència el patró P5 amb 5 (3,9%) aïllats, els patrons P3, P4 i P6 van agrupar a 3 aïllats cadascun (2,4%), els patrons P8 i P12 amb 2 aïllats (1,6%) i finalment els patrons P7, P10, P13 i P14 amb 1 aïllat cadascun (0,8%). La soca control M. tuberculosis ATCC 25177, va mostrar un perfil de restricció que no va permetre la seva inclusió en cap dels patrons descrits. El poder discriminatori del mètode (HGDI) va ser de 0,5812 enfront de 0,9843 de la tècnica MIRU-15, que va agrupar a 69 soques (54,8%) en 20 complexos clonals i 57 patrons únics (45,2%). Per al cas d'Espanya, les soques van estar relacionades majoritàriament amb el llinatge 4 o Euro-Americà que inclou: Cammeroon (1,59%), Haarlem (36,51%), S (31,75%), i LAM (19,05%); el llinatge 6 o West Africa I (9,53%), el llinatge 1 o EIA (1,59%), Pel cas de l'Equador les soques estaven relacionades amb el llinatge 4: Haarlem (42,86%), S ( 33,33%), i LAM (22,22%) i el llinatge 2 Beijing (1,59%) originari d'Àsia. La tècnica Miru-VNTR (15 loci) va demostrar ser un sistema estable, reproduïble i amb un poder discriminatori alt en comparació amb AFLPs, el que permetria emprar-lo per realitzar estudis poblacionals prospectius amb la finalitat de contribuir als programes de salut pública per al control de la Tuberculosi (TB).