Caracterización fenológica, morfológica, fisiológica, fitoquímica, y molecular de las especies silvestres españolas del género Crocus

Abstract

[EN] The genus Crocus belonging to the family Iridaceae, is known for its cultivated species, saffron (Crocus sativus L.). The genus includes about 100 species, many of which are of interest as ornamentals for their products or secondary metabolism, and others are exclusively wild. On the whole, they are a source of genetic variability of enormous interest. The rapid disappearance of the culture of saffron in Europe due to the significant amount of manpower required, has led to significant genetic erosion. In order to slow down and improve this situation, several national and European programs for the collection, multiplication, and characterization of germplasm of saffron and related species were initiated. In this context, this Thesis aims to complete the existing collections and characterize the available germplasm of the Spanish wild species of the genus Crocus, conserved in the Plant Germplasm Bank of the Center for Research in Agroforestry in Albaladejito (Cuenca). Seven wild species of this genus can be found in Spain, which are both autumn flowering species (C. serotinus, C. clusii, C. nudiflorus and C. cambessedesii) and spring flowering species (C. nevadensis, C. carpetanus and C. vernus), and in this work a morphological, physiological, biochemical and molecular characterization of them has been carried out. After a thorough review of the locations of these species in Spain, we have collected accessions from different locations in which their presence was described. We have developed location maps, and the description of the ecosystems these species inhabit. Of this set of accessions, a maximum of 60, which form a representation of the observed variability, were characterized morphologically. It should be noted that a microscopic characterization of the anatomy of the leaves and seed coat also identifies most species. A total of 115 accessions, representing different populations of each species collected, have been characterized phenologically. In addition, 1-2 accessions of each autumn flowering species, C. serotinus and C. nudiflorus (with hysterantia), and the spring-flowering species, C. nevadensis, C. carpetanus and C. vernus (this last species has the latter flowering date), have been characterized physiologically. We have studied the influence of temperature on the development of floral meristems in flowering, in the vegetative development, set and development of fruit and leaf senescence. These physiological studies have also allowed developing methods to break dormancy and germination, which allow a percentage of germination of the Spanish species of Crocus of around 81-95%. The biochemical characterization of 15 accessions belonging to 5 species of Spanish wild Crocus has revealed the lower content of crocins in its styles. Two of these species, C. carpetanus and C. nevadensis, have no crocins in the style. The analysis of the absence and presence of main peaks corresponding to crocins and flavonoids has enabled to separate each species which has crocins, but has provided no separation between C. nevadensis and C. carpetanus. The molecular characterization of 133 individuals, corresponding to 26 different accessions of the 7 species, using RAPDs, indicates that these markers can be a useful tool for differentiating species that share ecological niche, or with very similar vegetative morphological features. Microsatellite markers have proved to be a complementary tool for the distinction of materials which cannot be distinguished by the use of RAPDs.

[ES] El género Crocus perteneciente a la familia de las Iridáceas, es conocido por su especie cultivada, el azafrán (Crocus sativus L.). El género incluye aproximadamente 100 especies, muchas de las cuales tienen interés como ornamentales o por sus productos de metabolismo secundario, y otras son exclusivamente silvestres. En su conjunto, constituyen una fuente de variabilidad genética de enorme interés. La rápida desaparición del cultivo del azafrán en Europa, debido a la importante cantidad de mano de obra que requiere, ha conducido a una importante erosión genética. Con el fin de frenar y mejorar esta situación, se han iniciado varios programas de ámbito nacional y europeo para la recolección, multiplicación, y caracterización de germoplasma de azafrán y especies afines. En ese contexto, se enmarca esta Tesis que tiene como objetivo completar las colecciones existentes y caracterizar el germoplasma disponible de especies silvestres españolas del género Crocus, del Banco de Germoplasma Vegetal del Centro de Investigación Agroforestal de Albaladejito (Cuenca). En España pueden encontrarse 7 especies silvestres de este género, que son tanto de floración otoñal (C. serotinus, C. clusii, C. nudiflorus y C. cambessedesii) como primaveral (C. nevadensis, C. carpetanus y C. vernus), y en este trabajo se ha llevado a cabo una caracterización morfológica, fisiológica, bioquímica y molecular de las mismas. Tras una revisión minuciosa de las citas sobre la localización de estas especies en España, se han conseguido entradas de distintas áreas de las zonas en las que se ha descrito su presencia. Se han elaborado mapas de localización, así como la descripción de los ecosistemas que habitan estas especies. De este conjunto de entradas, un máximo de 60, que configuran una representación de la variabilidad observada, fueron caracterizadas morfológicamente. Hay que destacar una caracterización microscópica de la anatomía de las hojas y de la cubierta de las semillas que permite también identificar la mayoría de las especies. Un total de 115 entradas, que representan las diferentes poblaciones recolectadas de cada especie, se han caracterizado fenológicamente. Asimismo, se han caracterizado fisiológicamente 1-2 entradas de las especies de floración otoñal C. serotinus y C. nudiflorus (con histerantia), y de tres especies de floración primaveral C. nevadensis, C. carpetanus y C. vernus (esta última con floración más tardía). Se ha estudiado la influencia de la temperatura en el desarrollo de los meristemos florales, en la floración, en el desarrollo vegetativo, el cuajado y desarrollo del fruto y sobre la senescencia de las hojas. Estos estudios fisiológicos también han permitido poner a punto métodos de rotura de latencia y germinación que permiten un porcentaje de germinación de entre un 81-95%. La caracterización bioquímica de 15 entradas correspondientes a 5 de las especies analizadas, ha revelado el menor contenido en crocinas de los estilos de estas especies silvestres, dándose la ausencia total de las mismas en C. carpetanus y C. nevadensis. El análisis de la ausencia y presencia de los principales picos que corresponden a crocinas y a flavonoides, ha permitido separar entre sí las especies que presentan crocinas, pero no ha facilitado la separación entre C. nevadensis y C. carpetanus. La caracterización molecular de 133 individuos que corresponden a 26 entradas diferentes mediante RAPD, indica que estos marcadores pueden ser una herramienta útil para la diferenciación de especies que comparten nicho ecológico, o con rasgos morfológicos vegetativos muy similares. Los marcadores microsatélites se han mostrado como una herramienta complementaria que permite la distinción de materiales que no es posible llevar a cabo mediante el empleo de marcadores tipo RAPD.

[CA] El gènere Crocus pertanyent a la família de les Iridaceae, és conegut per la seua espècie conreada, el safrà (Crocus sativus L.). El gènere inclou aproximadament 100 espècies, moltes de les quals tenen interès com a ornamentals o pels seus productes de metabolisme secundari, i altres són exclusivament silvestres. El seu conjunt, constitueix una font de variabilitat genètica d'enorme interès. La ràpida desaparició del cultiu del safrà a Europa, a causa de la important quantitat de mà d'obra que requereix, ha conduït a una important erosió genètica. Per tal de frenar i millorar aquesta situació, s'han iniciat diversos programes d'àmbit nacional i europeu per a la recol·lecció, multiplicació, i caracterització de germoplasma de safrà i espècies afins. En aquest context, s'emmarca aquesta Tesi que té com a objectiu completar les col·leccions existents i caracteritzar el germoplasma disponible d'espècies silvestres espanyoles del gènere Crocus, del Banco de Germoplasma Vegetal del Centro de Investigación Agroforestal de Albaladejito (Cuenca). A Espanya es poden trobar 7 espècies silvestres d'aquest gènere, que són tant de floració tardoral (C. serotinus, C. clusii, C. nudiflorus i C. cambessedesii) com primaveral (C. nevadensis, C. carpetanus i C. vernus), i en aquest treball s'ha dut a terme una caracterització morfològica, fisiològica, bioquímica i molecular de les mateixes. Després d'una revisió minuciosa de les cites sobre la localització d'aquestes espècies a Espanya, s'han aconseguit entrades de diferents àrees de les zones en què s'ha descrit la seua presència. S'han elaborat mapes de localització, així com la descripció dels ecosistemes que habiten aquestes espècies atenent: tipus de sòl, altitud, clima, comunitat vegetal i els estressos abiòtics o biòtics més freqüents. D'aquest conjunt d'entrades, un màxim de 60, que configuren una representació de la variabilitat observada, van ser caracteritzades morfològicament. Cal destacar una caracterització microscòpica de l'anatomia de les fulles i de la coberta de les llavors que permet també identificar la majoria de les espècies. Un total de 115 entrades, que representen les diferents poblacions recol·lectades de cada espècie, s'han caracteritzat fenológicament. Així mateix, s'han caracteritzat fisiològicament 1-2 entrades de les espècies de floració de tardor C. serotinus i C. nudiflorus (amb histerantia), i de tres espècies de floració primaveral C. nevadensis, C. carpetanus i C. vernus (aquesta última amb floració més tardana). S'ha estudiat la influència de la temperatura en el desenvolupament dels meristemes florals, en la floració, en el desenvolupament vegetatiu, el quallat i desenvolupament del fruit i sobre la senescència de les fulles. Aquests estudis fisiològics també han permès posar a punt mètodes de trencament de latència i germinació que permeten un percentatge de germinació de llavors de les espècies espanyoles de Crocus entre un 81-95%. La caracterització bioquímica de 15 entrades corresponents a 5 de les espècies analitzades, ha revelat el menor contingut en crocinas d'aquestes espècies silvestres, donant-se l'absència total de les mateixes en C. carpetanus i C. nevadensis. L'anàlisi de l'absència i presència dels principals pics que corresponen a crocinas i flavonoides, ha permès separar entre si les espècies que presenten crocinas, però no ha facilitat la separació entre C. nevadensis i C. carpetanus. La caracterització molecular de 133 individus que corresponen a 26 entrades diferents mitjançant RAPD, indica que aquests marcadors poden ser una eina útil per a la diferenciació d'espècies que comparteixen nínxol ecològic, o amb trets morfològics vegetatius molt similars. Els marcadors microsatèl·lits s'han mostrat com una eina complementària que permet la distinció de materials que no és possible dur a terme mitjançant l'ús de marcadors tipu