Regulation of multidrug transport by anti-cancer drugs and immunosuppressors in yeast

Abstract

[EN] Fungi (yeasts) and human cells have developed defense systems against a wide variety of chemical compounds (toxins, drugs, etc). These adaptive responses are known as the "Pleiotropic Drug Resistance (PDR)". Activation of PDR in fungi can cause a hyperresistance against anti fungal treatments and can cause resistance to anti-tumor treatments in human cells. The central part of PDR form multiple transcriptional activators that activate gene expression of different types of ABC transporters. Result of the activation of PDR is the overexpression of one or more multi drug exporters which help the cell to lower the intracellular levels of the chemical. In yeast, activators such as the "zinc cluster" proteins Pdr1, Pdr3 and others are responsible for the rapid transcriptional activation of genes encoding drug transporters such as PDR5, PDR15, SNQ2, YOR1 and others through promoter sequences called PDRE ("Pleiotropic Drug Resistance Element"). It is not yet understood how a wide variety of chemical compounds activate the defense throuhg PDR in a specific manner for each drug or toxin. In the proposed work we will examine and, if possible, genetically decipher the transcriptional activation of several multi drug transporter genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae in response to different therapeutical molecules with anti-tumor and anti-inflammatory characteristics. As an experimental tool, a reporter system based of destabilized luciferase (lucCP+) will be applied to quantify in real time and in vivo the activation of gene expression in response to different drugs. Yeast strains with several promoters of genes for drug transporters such as PDR5, PDR15, SNQ2 and YOR1 fused to lucCP+ will be used. The following chemical agents will be applied: Menadione (control treatment for induction of yeast PDR), Paclitaxel (anti-cancer agent), doxorubicin (antibiotic anthracycline family member with extensive applications in chemotherapy), Cyclosporine A (potent suppressor of the immune system with applications in organ transplantation) and Rapamycin (immunosuppressant used in organ transplantation). The dose dependent response to each compound will be determined for the quantitative comparison of the different drug transporters. Additionally, another reporter system will be applied consisting of lucCP+ encoded in plasmids under the control of various PDRE elements. This experimental approach allows to quantitatively study the sensitivity to each chemical compound conferred by the different transcription factors of the PDR1 family. In summary, this study is designed to determine the sensitivity of transcriptional control in yeast PDR and the involvement of different specific transcription factors in the response to drugs of different structure.

[ES] Hongos (levaduras) y células humanas tienen sistemas de defensa contra una gran diversidad de compuestos químicos (toxinas, drogas, fármacos etc). Estas respuestas adaptativas se llaman generalmente ¿Resistencia pleiotrópica a drogas¿ o ¿Pleiotropic Drug Resistance (PDR)¿. La activación de PDR en hongos puede causar una hiperresistencia de hongos patógenos a tratamientos anti fúngicos y en células humanas puede causar la resistencia a tratamientos anti tumorales. La parte central de PDR forman múltiples activadores transcripcionales que activan la expresión génica de diferentes tipos de transportadores de la familia ABC. Resultado de la activación de PDR es la sobreexpresión de uno o varios exportadores multi droga que ayuda a la célula de bajar los niveles intracelulares del compuesto químico. En levadura son los activadores del tipo ¿zinc cluster¿ como Pdr1, Pdr3 y otros que se encargan de la rápida activación transcripcional de genes que codifican transportadores multi droga como PDR5, PDR15, SNQ2, YOR1 y otros a través de secuencias promotoras denominadas PDRE (¿Pleiotropic Drug Resistance Element¿). Aún no se entiende como una gran diversidad de compuestos químicos activa una defensa PDR específica para cada droga o toxina. En este trabajo queremos estudiar y, si es posible, descifrar genéticamente la activación transcripcional de varios transportadores multi droga en la levadura Saccharomyces cerevisiae en respuesta a distintas moléculas de uso anti tumoral y anti inflamatorio. Como herramienta experimental se aplicará el sistema reportero de la luciferasa desestabilizada (lucCP+) para cuantificar en tiempo real e in vivo la activación de la expresión génica en respuesta a los diferentes fármacos. Se usarán cepas de levadura que tienen fusionados con lucCP+ varios promotores de genes para transportadores multi droga como PDR5, PDR15, SNQ2 y YOR1. En los tratamientos químicos se incluirán, entre otros, los siguientes agentes: Menadiona (tratamiento control para la inducción de PDR en levadura), Paclitaxel (agente anti cancerígeno), Doxorrubicina (antibiótico de la familia de antraciclinas con amplias aplicaciones en quimioterapia), Ciclosporina A (potente supresor del sistema inmune con aplicaciones en el trasplante de órganos) y Rapamicina (inmunosupresor utilizado en el trasplante de órganos). Se determinará la respuesta dependiente da la dosis de cada compuesto para la comparación cuantitativa de los distintos transportadores. Adicionalmente se aplicará otro sistema reportero que consiste en lucCP+ codificada en plásmido bajo el control de varios elementos PDRE. Este abordaje experimental permitirá estudiar de forma cuantitativa la sensibilidad a cada compuesto químico de los factores de transcripción de la familia Pdr1. En resumen, el presente trabajo está diseñado para determinar las sensibilidades de control transcripcional de PDR en levadura y la implicación de diferentes factores específicos de transcripción en la respuesta a fármacos de estructura diferente.