Efecto del tratamiento de superovulación sobre la calidad embrionaria en conejo

Abstract

[EN] Superovulation in animals is used to produce a maximum number of transferable embryos per donor, in order to support both genetic improvement programs and ex situ conservation or to optimize other biotechnologies. Over time, the use of this biotechnology h as shown variable outcomes as a consequence of several factors, such as the origin of exogenous hormone, its administration mode, the donor and the environment. Nowadays the use of gonadotropins such as FSH, LH, hCG and eCG has enabled us to achieve the su perovulation in different species successfully . However , the posology and the effect of both gonadotropins when used simultaneously (e.g. FSH and LH) it is not yet clearly defined. The superovulation in rabbit does and in other species, has had a great adv ance in recent years, changing the eCG use by the recombinant gonadotropins and jumping the morphological classification to the molecular analysis of embryos. The objective of this study was to evaluate the effect of long - acting FSH - CTP and rhFSH alone or supplemented with rhLH on ovarian stimulation in rabbit does and determine the impact of its stimulation on in vitro and in vivo development of fresh and cryopreserved embryos. Our outcomes showed that both the ovulation rate and the mean of recovered transferable embryos per donor were similar among the different ovarian stimulation groups (FSH - CTP, FSH - CTP+rhLH, rhFSH, rhFSH+rhLH), but much higher than the control group. In v itro viability of superovulated embryos from FSH - CTP group was similar to the embryos from the control group until blastocysts stage at 48 hours, but it was higher at expanded blastocyst stage for FSH - CTP group in relation to the control group at 48 hours. The embryo development at any stage was affected by the vitrification process. However , it seems that ovarian stimulation did not affect the SOX2 and OCT4 gene expression . NANOG gene overexpression was observed in embryos from FSH - CTP, FSH - CTP+rhLH and rh FSH in concordance with the higher in vitro embryo development of these groups. In vivo viability of embryos from both FSH - CTP and FSH - CT P+rhLH experimental groups was similar to the embryos viability from the control group. The in vivo embryo viability a t implantation stage was affected by the vitrification process, but foetal losses and birth rate was not affected. Nevertheless, it seems that the vitrification did not affect the in vivo viability of embryos from FSH - CTP and rhFSH groups in relation to th e control group. II There was no difference in the litter size and weight at birth and weaning among the experimental groups. The vitrification did not affect the litter size at birth and weaning but the pup weight who came from the vitrified embryos was five per cent higher than the one in the fresh groups. By contrast, weight at weaning was lower than the fresh group . In conclusion, the results of this study suggest that the use of FSH - CTP (3 μg/doe) is enough to superovulate rabbit does without compromisin g the quantity and quality of embryos, either fresh or vitrified. In addition, the use of this hormone reduces the frequency of animal handling, improving the animal welfare too .

[ES] La biotecnología de la reproducción ofrece una amplia gama de técnicas que permiten aumentar la eficiencia reproductiva. De entre estas tecnologías, es de especial interés la superovulación, debido a los elevados costes de las técnicas de recuperación de ovocitos y embriones y a las bajas eficiencias de determinados procesos a los que pueden destinarse posteriormente. Sin embargo, los procedimientos de superovulación presentan una serie de limitaciones, como son la variabilidad en la respuesta y las alteraciones en la calidad de óvulos y embriones, lo que ha impulsado tanto los estudios sobre la foliculogénesis y ovogénesis como el desarrollo de nuevos productos y modos de administración que reduzcan los efectos no deseados. En producción animal, desde los años 60 los tratamientos de superovulación se han basado en la utilización de gonadotropinas de dos tipos según el origen biológico: coriónicas (gonadotropina coriónica equina o eCG) e hipofisarias (FSH ya sea porcina, ovina, equina o recombinante), existiendo cierto debate sobre el tratamiento que consigue una mayor respuesta superovulatoria. Uno de los factores es la incapacidad para controlar la contaminación por parte de la LH en los extractos de FSH, que no sólo aumenta la variabilidad, sino que se ha visto en ganado que disminuye el número de embriones transferibles. Esto se debe a que el aumento en la cantidad de LH en el protocolo de superovulación puede producir la activación de receptores de LH que den lugar a una luteinización prematura, produciendo una ovulación temprana y una disminución de los ratios de fecundación y producción de embriones. Además, las isoformas de LH presentes en el preparado de FSH, pueden interferir en la efectividad de la FSH. Además respuesta no sólo dependerá del tipo y la concentración de gonadotropinas empleadas, sino que depende de un complejo sistema de señales paracrinas y autocrinas de los factores producidos por los propios folículos que pueden amplificar o atenuar la respuesta al tratamiento, siendo necesario la sincronización del ciclo y el control de las oleadas foliculares.

OBJETIVOS Los objetivos de este Trabajo Final de Máster serán: - Evaluar el efecto de las gonadotropinas recombinantes humanas (rhFSH y rhLH), oFSH y de la alfa-corionfolitropina sobre la estimulación ovárica, la tasa de fecundación y recuperación embrionaria, utilizando el conejo como modelo animal. - Determinar el impacto que el tratamiento de superovulación tiene sobre la calidad de los embriones, empleando como indicadores tanto el desarrollo in vitro hasta blastocisto como la expresión de genes fundamentales implicados en el desarrollo embrionario: octamer-binging transcription factor (OCT4), NANOG homeobox (NANOG) y sex determining región Y-box 2 (SOX2). - Conocer la criotolerancia de los embriones superovulados a un proceso de vitrificación para su incorporación de éstos al banco de embriones. - Estudiar el efecto que el tratamiento sobre el desarrollo fetal y postnatal de embriones superovulados y transferidos.

PLAN DE TRABAJO: Los objetivos se abordaran en tres experimentos: Durante 10 semanas, 2-3 conejas asignadas a cada grupo serán con la dosis hormonal correspondiente a cada grupo experimental. Conejas de los grupos rFSH-rLH y oFSH recibirán 5 dosis cada 12 horas y 10-12 horas después de la última dosis, las hembras serán inseminadas artificialmente (IA). El grupo de conejas tratadas con alfa-coriofolitropina recibirá una única dosis 60horas antes de ser inseminadas. Tras 72 horas, se recuperaran los embriones mediante la perfusión de los oviductos. Los embriones recuperados serán evaluados atendiendo a su estado de desarrollo y morfología, incubados en medio y condiciones definidas durante 48h o vitrificados y desvitrificados y cultivados durante 48h. Tras la incubación, se llevará a cabo la extracción del ARN mensajero (ARNm) de los embriones que alcanc