Efectos del silenciamiento del gen TMBIM6 en Drosophila melanogaster

Abstract

[ES] TMBIM6 o Bax inhibitor 1 es un miembro de la familia de proteínas llamadas transmembrane BAX inhibitor motif containing o TMBIM expresado en el retículo endoplasmático de células del músculo esquelético, hígado, bazo y riñón, que está involucrado en la regulación del calcio celular, cuya función es dependiente de PH. El cribado de librerías de cDNA humano para descubrir proteínas capaces de suprimir la muerte de levadura inducida por la expresión ectópica de la proteína Bax, permitieron vislumbrar la función citoprotectora de esta proteína. Ensayos similares se llevaron a cabo para identificar proteínas con la misma función en otras especies, lo que llevó al descubrimiento y caracterización básica del homólogo en Drosophila melanogaster (CG7188). Se demostró la homología funcional con la proteína humana, protegiendo a las células de la muerte inducida por la proteína proapoptótica Bax, del shock térmico y del estrés oxidativo. En trabajos posteriores se ha observado como la deficiencia de BI-1 lleva a una acumulación de vesículas ácidas y autofagosomas (en larva) y aumenta la supervivencia en condiciones de inanición en Drosophila. Pero no existen trabajos que hayan profundizado en la función de dicha proteína en organismo adulto de Drosophila. Por todo ello es interesante estudiar el efecto del silenciamiento del gen en un organismo vivo como es Drosophila melanogaster. Se usarán dos cepas UAS diferentes que permitirán el silenciamiento (ARN de interferencia) del gen CG7188: [3235] y [37108] obtenidas del Vienna Drosophila Resource Center (VDRC). Estas cepas transgénicas contienen unas secuencias denominadas UAS, que preceden la secuencia del RNAi, se trata de promotores que dictarán el silenciamiento de nuestro gen de interés, dicho silenciamiento solo se producirá si la secuencia UAS se activa. Por otra parte, utilizaremos dos cepas Gal4, son las que nos van a permitir la expresión dirigida y el silenciamiento en el tejido de interés. Estas cepas contienen la proteína Gal4 de levadura expresada bajo el promotor específico de tejido, se trata de un activador de la transcripción cuyo sitio de unión son las secuencias UAS. En nuestro caso, utilizaremos la Actina y la cadena pesada de miosina para dirigir la expresión en todo el organismo o en músculo respectivamente. Las moscas experimentales serán resultado del cruce entre las moscas UAS por las moscas Gal4 , de esta manera tendremos individuos con la expresión reducida de nuestro gen de interés en todo el organismo y en músculo. Se estudiará la viabilidad, haciendo curvas de supervivencia; la degeneración muscular y anormalidades mitocondriales mediante histología. Además, estudiaremos las variaciones metabólicas utilizando técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN).

[EN] TMBIM6 or Bax inhibitor 1 it's a memebr of a family protein called transmembrane BAX inhibitor motif containing or TMBIM. It is expressed in endoplasmic reticulum of skeletal muscle cells, liver, spleen and kidney, which is involved in the regulation of cell calcium, whose function is dependent on pH. Screenings of human cDNA libraries, to discover proteins capable of suppressing yeast death induced by ectopic expression of Bax protein, have uncovered its cytoprotective function. Similar assays were done to identify proteins with the same function in other species, which led to meet the homologue in Drosophila melanogaster (CG7188), then it demonstrated how its functions and the human protein are equal, protecting cells from the death induced by the proapoptotic protein Bax, heat shock and oxidative stress. Also it has been observed that the BI -1 deficiency leads to an accumulation of acid vesicles and autophagosomes and increases survival under starvation conditions in Drosophila. But it hasn t been studied BI-1 function in Drosophila adults. It will be used two different "UAS" strains that allow us to silence CG7188 gene expression: [3235] and [37108] obtained from Drosophila Resource Center Vienna (vDRC). These transgenic strains containing UAS sequences, upstream RNAi sequence, which are promoters that will lead the silencing of our gene of interest, it only will occur if the UAS sequence is activated. Furthermore, we will use two Gal4 strains that enable to silence our gene of interest in a tissue specific manner. These strains contain the yeast Gal4 protein expressed under the tissue specific promoter. Gal4 is a transcriptional activator whose binding site is the UAS sequence. In our case, we use the actin and myosin heavy chain to direct expression in the whole body or muscle, respectively. Experimental flies are the result of crossing "UAS" flies with "Gal4" flies, so individuals will have a reduced expression of our gene of interest throughout the body and thorax muscle. We are going to study viability by survival curves and muscle degeneration and mitochondrial disorders by histology. In addition, we will analyse the metabolic variations using nuclear magnetic resonance (NMR).