El virus del manchado foliar de los cítricos: caracterización del promotor del RNA subgenómico del gen de la proteína de la cápsida y del supresor del silenciamiento de RNA

Abstract

El trabajo incluido en esta tesis está encuadrado en un proyecto cuyo objetivo general es el desarrollo de un vector viral eficiente de expresión o silenciamiento de genes, basado en el virus del manchado foliar de los cítricos (Citrus leaf blotch virus, CLBV). Para desarrollar un vector viral a partir del genoma de CLBV era necesario disponer de un clon infeccioso del virus y de métodos eficientes de inoculación del mismo en plantas de cítricos. Se construyó un clon infeccioso de cDNA del genoma completo de CLBV bajo el promotor T7 del fago lambda y se pusieron a punto protocolos para el aislamiento de protoplastos de N. benthamiana, N. occidentalis y cidro Etrog. CLBV replicó en protoplastos de las tres especies transfectados con viriones purificados, aunque el nivel de replicación fue muy bajo y sólo se detectó a partir de 4-5 días post inoculación (dpi), que es el tiempo máximo de supervivencia de los protoplastos en nuestras condiciones de trabajo. La multiplicación del virus en protoplastos inoculados con transcritos de CLBV fue menor, detectándose sólo en algunos experimentos de transfección de protoplastos de N. benthamiana. Finalmente, la inoculación mecánica directa de plantas de cítricos o de N. benthamiana y N. occidentalis con transcritos de RNA del virus fue infructuosa, a pesar de que estos transcritos eran capaces de infectar protoplastos. Antes de modificar el clon infeccioso de CLBV para convertirlo en un vector viral eficiente, era necesario conocer la estrategia de expresión del genoma viral y caracterizar las secuencias implicadas en el reconocimiento y promoción de la síntesis de los RNAs subgenómicos (sgRNAs) para poder duplicar un promotor y expresar genes o fragmentos de genes mediante la formación de un nuevo sgRNA. Para mapear el promotor del CP-sgRNA de CLBV se construyeron varios mutantes a partir del clon IC-CLBV (clon infeccioso del genoma completo de CLBV bajo el promotor 35S de CaMV) mediante supresión de nucleótidos y mutagénesis dirigida.