Utilización de la fluorescencia de azul de anilina como nuevo método para evaluar la compactación de la cromatina en espermatozoides

Abstract

[EN] It is estimated that male factors related to semen quality constitute half of the infertility causes . However, current techniques used to assess semen qual ity are not always able to predict the sperm fertilizing capacity or the resulting embryo quality and their implantation capability and fetal development to term. Therefore, it is still currently under investigation the finding of new techniques to assess the seminal quality having greater predictive power of reproductive success. Currently the techniques that are being studied and developed are focus on assessing the state of the sperm chromatin. This is because their level of compaction in the sperm chrom atin plays an important role in motility, epigenetics, DNA protection, etc. which are essential for sperm fertilizing capa city and generate a high quality embryo . One of the techniques employed to evaluate the chromatin compaction is aniline blue staining that stains residual histones present in the chromatin of immature or defective sperm atozoa . In this paper we reviewed this staining in order to improv e its objectivity and we propose a methodology to quantify the intensity of staining and therefore the le vel of chromatin compaction . We have also discovered an unknown fluorescent property of aniline blue staining that we have used to assess the chromatin compaction by fluorescence microscopy and flow cytometry. With this new methodology we were able to disc ern between mature and immature populations of sperm atozoa in mouse, pig and human faster and more objectively tha n the current one . The results show a great potential of the technique for its use in medical and veterinary clinics as well as for basic rese arch on the structure of the sperm chromatin

[ES] Se estima que los factores masculinos relacionados con la calidad del semen constituyen la mitad de las causas que provocan infertilidad. Sin embargo las actuales técnicas utilizadas para evaluar la calidad seminal no siempre son capaces de predecir la capacidad fecundante del semen o la calidad del embrión resultante, su capacidad de implantación y desarrollo fetal a término. Por tanto, actualmente se sigue investigando en busca de nuevas técnicas para evaluar la calidad seminal que tengan un mayor carácter predictivo del éxito reproductivo. Actualmente las técnicas que más se están estudiando y desarrollando se enfocan en la evaluación del estado de la cromatina espermática. Esto se debe a que su nivel de compactación en el espermatozoide juega un papel importante en la motilidad, epigenética, protección del ADN, etc. que son clave para la capacidad fecundante del espermatozoide y para generar un embrión de calidad. Una de las técnicas más usadas para evaluar la compactación de la cromatina es el azul de anilina que tiñe histonas residuales presentes en la cromatina de espermatozoides inmaduros o defectuosos. En este trabajo hemos revisado dicha tinción mejorando su objetividad proponiendo una metodología que permite cuantificar el grado de tinción y por ende el nivel de compactación de la cromatina. Además hemos descubierto una desconocida propiedad fluorescente del azul de anilina que hemos empleado para evaluar el estado de la cromatina tanto por microscopía de fluorescencia como por citometría de flujo. Con esta nueva metodología hemos sido capaces de discernir entre poblaciones de espermatozoides maduros e inmadura de ratón, cerdo y humano de una manera más rápida y objetiva que la utilizada hasta la fecha. Los resultados revelan un gran potencial de la técnica tanto para su uso en clínica médica y veterinaria como para la investigación básica de la estructura de la cromatina del espermatozoide.