TRANSMISIÓN DE HELICOBACTER PYLORI A TRAVÉS DEL AGUA: ESTUDIO DE LA PRESENCIA DEL PATÓGENO E IDENTIFICACIÓN DE FORMAS VIABLES MEDIANTE TÉCNICAS MOLECULARES

Abstract

Abstract Helicobacter pylori occupies a prominent position among emerging human pathogens, one of the most common causes of chronic bacterial infection in humanity and closely linked to peptic ulcers and gastric cancer. It has been suggested that H.pylori can be acquired by different routes of transmission, including water. The growing demand for water due to increasing world population and the concurrent expansion of the industry necessitates the use of treated wastewater. However, H. pylori resistance to water disinfection treatment constitutes a risk to health.

Similarly, H.pylori has resilience to water purification treatments and at high concentrations of free chlorine in distribution systems by biofilm formation. The VBNC state of H.pylori in both matrices is the usual in stress conditions, necessitating the application of molecular techniques for detection and identification.

In this thesis we have studied the presence and viability of this important pathogen in both wastewater and drinking water.

A total of 60 wastewater samples, including samples of the biological reactor inlet, the outlet of this one and samples after tertiary ultraviolet disinfection treatment, were analyzed for the presence of H.pylori by PCR, q-PCR and FISH and the traditional cultivable technique.

The FISH technique proved to be an effective and rapid method for the detection of H. pylori in waste and debugged water (61.2 %), without the need for a preliminary step enrichment of samples. The PCR and q-PCR techniques determined the presence of H. pylori in the samples, with detection rates of both 15 %. It was possible to quantify only in 3 direct samples belonging to the reactor inlet and outlet (1.8x10; 1.5x10 and 6.3x10 GU/mL), the other samples had the Ct above the threshold of reliability (> 35 cycles).

Although the culture turned out to be a not fully resolutive method, the method of isolation by 0.65 µm membrane, tuned in this thesis, was effective in reducing the accompanying microbiota and to obtain cultivable H. pylori for the first time from debugged water.

Similarly, 63 drinking water samples from 51 public drinking water sources located on the coastal area in Eastern Spain, were analyzed and could be confirmed for the first time the presence of viable cells of the pathogen in drinking water.

FISH and q-PCR techniques were effective for detecting H. pylori with detection rates of 46 % and 50.8 % respectively. For detection of viable cells of H. pylori in drinking water DVC-FISH technique it proved to be a more effective tool than the PMA-qPCR, with a detection rate of 38 % viable cells. Quantitation of viable cells was possible by obtaining values between 4x102 and 1.6x103 viable cells of H.pylori/mL. Despite the difficulty of culturing the pathogen H. pylori it was identified in a sample after 24 hours enrichment.

Detection of mutations in the 23S, in specific resistance to clarithromycin, indicated that 41.6% of the samples of wastewater and 17.4% of drinking water samples had H.pylori with this potential resistance.

The results confirm the ability of H.pylori to survive the water purification treatments in a wastewater treatment plant, it should be considered when evaluating the potential risk in reuse for irrigation. Moreover, H.pylori is found in the distribution systems of drinking water, so its consumption may be a risk to human health, since they are a possible route of transmission of the pathogen. The presence of clarithromycin-resistant H.pylori in the environment, show the need to monitor effective control of the pathogen, since water can pose a risk to the expansion of resistance and consequent therapeutic failures in clinical practice.

Given the role of water in the transmission of H.pylori, confirmed in this thesis, the established protocols are proposed, mainly the DVC-FISH method, as they can be validated for an efficient environmental control of H.pylori.

Resumen Helicobacter pylori ocupa una posición destacada entre los patógenos humanos emergentes, siendo una de las causas más comunes de infección crónica bacteriana en la humanidad y estrechamente relacionada con la úlcera péptica y el cáncer gástrico. Se ha sugerido que H.pylori puede ser adquirido por diferentes vías de transmisión, entre ellas el agua. El aprovechamiento de las aguas residuales depuradas y la resistencia de H. pylori a los tratamientos de desinfección del agua constituye un riesgo para la salud. De igual forma, H.pylori presenta capacidad de resistencia a tratamientos de potabilización y a concentraciones elevadas de cloro libre en los sistemas de distribución gracias a la formación de biopelículas. El estado VNC de H.pylori, en ambas matrices, hace necesario la aplicación de técnicas moleculares para su detección e identificación. En esta tesis doctoral se ha estudiado la presencia y viabilidad de este importante patógeno tanto en agua residual como potable.

Un total de 60 muestras de agua residual, incluyendo muestras de la entrada del reactor biológico, de la salida de éste y tras el tratamiento de desinfección con UV, se analizaron para detectar la presencia de H. pylori mediante las técnicas moleculares PCR, q-PCR y FISH y cultivo en placa.

La técnica FISH resultó ser un método eficaz y rápido para la detección de H. pylori en las aguas residuales y depuradas (61.2 %), sin la necesidad de un paso previo de enriquecimiento de las muestras. Las técnicas PCR y q-PCR determinaron la presencia de H.pylori en las muestras, con porcentajes de detección de ambas del 15 %. Fue posible cuantificar únicamente en 3 muestras directas, pertenecientes a la entrada y salida del reactor (1.8x10; 1.5x10 y 6.3x10 GU/ mL). Aunque el cultivo resultó ser un método poco resolutivo, el método de aislamiento mediante membrana de 0.65 µm, puesto a punto en esta tesis doctoral, resultó eficaz para reducir la microbiota acompañante y poder obtener H.pylori cultivable por primera vez a partir de aguas depuradas.

De igual modo, se analizaron 63 muestras de agua potable procedentes de 51 fuentes públicas de agua potable, pudiendo confirmar por primera vez la presencia de células viables del patógeno en aguas de consumo.

Las técnicas FISH y q-PCR resultaron eficaces para la detección de H. pylori con unas tasas de detección de 46 % y 50.8 % respectivamente. Para la detección de células viables de H.pylori en agua potable la técnica DVC-FISH resultó ser una herramienta efectiva. Fue posible la cuantificación de células viables obteniendo valores comprendidos entre 4x102 y 1.6x103 células viables de H. pylori /mL. A pesar de la dificultad de cultivar el patógeno, se identificó H. pylori en una muestra tras el enriquecimiento de 24 horas.

La detección de mutaciones en el 23S, específicas en la resistencia a la claritromicina, indicó que el 41.6% de las muestras de agua residual y el 17.4 % de las muestras de agua potable presentaban H.pylori con dicho potencial.

Los resultados obtenidos confirman la capacidad de H.pylori de sobrevivir a los tratamientos de depuración del agua en una estación de depuración de aguas residuales, lo que debería ser considerado al evaluar el riesgo potencial de su reutilización para el riego. Por otra parte, H.pylori se encuentra en los sistemas de distribución de agua potable, por lo que el consumo de éstas puede representar un riesgo para la salud humana. La presencia de H.pylori resistente a la claritromicina en el ambiente, evidencia la necesidad de monitorizar un control eficaz del patógeno, ya que el agua puede suponer un riesgo para la expansión de las resistencias, y los consiguientes fallos terapéuticos en la práctica clínica. Dado el papel del agua en la transmisión de H. pylori, confirmado en esta tesis doctoral, se proponen los protocolos establecidos, principalmente el método DVC-FISH, como validables para el

Resum Helicobacter pylori ocupa una posició destacada entre els patògens humans emergents, sent una de les causes més comuns d'infecció crònica bacteriana en la humanitat i estretament relacionada amb l'úlcera pèptica i el càncer gàstric. S'ha suggerit que H. pylori pot ser adquirit per diferents vies de transmissió, entre elles l'aigua. L'aprofitament de les aigües residuals depurades i la resistència d'H. pylori als tractaments de desinfecció de l'aigua constitueix un risc per a la salut.De la mateixa manera, H. pylori presenta capacitat de resistència a tractaments de potabilització i a concentracions elevades de clor lliure en els sistemes de distribució gràcies a la formació de biopel¿lícules. L'estat VNC de H. pylori, en ambdues matrius, fa necessari l'aplicació de tècniques moleculars per a la seva detecció i identificació.

En aquesta tesi doctoral s'ha estudiat la presència i viabilitat d'aquest important patogen tant en aigua residual com potable.

Un total de 60 mostres d'aigua residual, incloent mostres de l'entrada del reactor biològic, de la sortida d'aquest i després del tractament de desinfecció amb UV, es van analitzar per detectar la presència de H. pylori mitjançant les tècniques moleculars PCR, q-PCR i FISH i cultiu en placa.

La tècnica FISH va resultar ser un mètode eficaç i ràpid per a la detecció de H. pylori en les aigües residuals i depurades (61.2 %), sense la necessitat d'un pas previ d'enriquiment de les mostres. Les tècniques PCR i q-PCR van determinar la presència de H. pylori en les mostres, amb percentatges de detecció de les dues del 15 %. Va ser possible quantificar únicament en 3 mostres directes, pertanyents a l'entrada i sortida del reactor (1.8x10; 1.5x10 i 6.3x10 GU/mL).

Tot i que el cultiu va resultar ser un mètode poc resolutiu, el mètode d'aïllament mitjançant membrana de 0.65 µm, posat a punt en aquesta tesi doctoral, va resultar eficaç per reduir la microbiota acompanyant i poder obtenir H. pylori cultivable per primera vegada a partir d'aigües depurades.

De la mateixa manera, es van analitzar 63 mostres d'aigua potable procedents de 51 fonts públiques d'aigua potable, i confirmar per primera vegada la presència de cèl¿lules viables del patogen en aigües de consum.

Les tècniques FISH i q-PCR van resultar eficaces per a la detecció de H. pylori amb unes taxes de detecció de 46 % i 50.8 % respectivament. Per a la detecció de cèl¿lules viables de H. pylori en aigua potable la tècnica DVC-FISH va resultar ser una eina efectiva. Va ser possible la quantificació de cèl¿lules viables obtenint valors compresos entre 4x102 i 1.6x103 cèl¿lules viables d'H. pylori /mL. Tot i la dificultat de conrear el patogen, es va identificar H. pylori en una mostra després de l'enriquiment de 24 hores.

La detecció de mutacions en el 23S, específiques en la resistència a la claritromicina va indicar que el 41.6 % de les mostres d'aigua residual i el 17.4 % de les mostres d'aigua potable presentaven H. pylori amb aquest potencial.

Els resultats obtinguts confirmen la capacitat de H. pylori de sobreviure als tractaments de depuració de l'aigua en una estació de depuració d'aigües residuals, el que hauria de ser considerat en avaluar el risc potencial de la seva reutilització per al reg. D'altra banda, H. pylori es troba en els sistemes de distribució d'aigua potable, per la qual cosa el consum d'aquestes pot representar un risc per a la salut humana. La presència de H. pylori resistent a la claritromicina en l'ambient, evidència la necessitat de monitoritzar un control eficaç del patogen, ja que l'aigua pot suposar un risc per a l'expansió de les resistències, i els consegüents errors terapèutics en la pràctica clínica.

Donat el paper de l'aigua en la transmissió d'H.pylori, confirmat en aquesta tesi doctoral, es proposen els protocols establerts, principalment el mètode DVC-FISH, com validables per al control ambient