Aportaciones a la epidemiología de Arcobacter y Helicobacter spp.: Aplicación de métodos moleculares a su detección e identificación en alimentos

Abstract

Bacteria of the Arcobacter genus are microorganisms belonging to the Campylobacteraceae family. Currently, the Arcobacter genus comprises 23 species, isolated from a variety of hosts and ecological niches. Although most of the pathogenic species are from fecal origin, seawater is considered to be the habitat for most of them. The transmission to humans seems to be associated to the consumption of raw food or not entirely-cooked. In this regard, the presence of pathogenic Arcobacter species in food of marine origin and vegetables has not been deeply studied.

When the detection and identification of Arcobacter is performed exclusively using conventional culture-based methods, the process is slow, tedious and rarely effective many times, originating frequently false negatives. Molecular biology-based methods analyzing nucleic acids with the use of the Polymerase Chain Reaction (PCR), are alternative procedure characterized by being reliable, faster, more sensitive. In this thesis we have analysed the presence of Arcobacter spp in 100 samples from shellfish and another 100 samples from vegetables using both approaches, on one side through the isolation and characterization by plate culture in and on the other side by PCR. The results obtained by both methods confirm the presence of Arcobacter spp. in the samples. An enrichment period followed by PCR has proved to be more sensitive than culture for the detection of the microorganism in the samples. In this study, Arcobacter contamination has been detected in 71 % of the shellfish samples and 20 % of vegetable samples.

The obtained Arcobacter isolates have been identified to the species level analyzing the 16 rRNA gene by PCR-RFLP. This technique has allowed the identification of the species A. butzleri, A. cryaerophilus and A. defluvii in the shellfish isolates, being the first time that A. defluvii is identified in clams. Additionally, it is also the first time that Arcobacter spp. is detected in cockles. A. butzleri and A. cryaerophilus have been isolated in vegetables being the last one the first time in this type of samples.

The sensitivity of the obtained isolates to ciprofloxacin and levofloxacin has also been studied. 2 % in analysed shellfish and 1 % in vegetables were contaminated with resistant strains. Three isolates from shellfish and 2 from vegetables, previously identified as A. butzleri, have shown resistance to both fluoroquinolones. In all of them, a mutation in the 254 position (C normal to T mutant) in the Quinolone Resistance-Determining Region (QRDR) of the gyrA gene has been detected. Our results regarding the presence of the pathogen in both types of samples are sufficiently relevant as to consider that the consumption of these contaminated foods with Arcobacter, especially A. butzleri, could suppose a risk for human health.

In addition, in this thesis the analisys of Helicobacter spp. and H. pylori by conventional PCR and real-time PCR has been carried out. The Helicobacter genus comprises a large number of species considered pathogenic. The most studied specie is H. pylori, one of the most common pathogens in humans and responsible of 90 % of peptic ulcers and closely related to the development of gastric cancer. Although it seems clear that H. pylori is transmited by fecal-oral route through the water, its presence in food is poorly known. Therefore, another objective of the present study has been to study the presence of these organisms in shellfish and vegetable samples. Helicobacter spp. or H. pylori could not be detected by conventional PCR. However, the real-time PCR technique allowed the detection of H. pylori in a sample from vegetables (lettuce).

Las bacterias del género Arcobacter son microorganismos pertenecientes a la familia Campylobacteraceae. Actualmente, el género Arcobacter comprende 23 especies, aisladas de una gran diversidad de hospedadores y nichos ecológicos. Las aguas de mar son consideradas el hábitat natural para muchas de ellas, aunque la mayor parte de las especies patógenas son de origen fecal. La transmisión al hombre parece estar asociada al consumo de alimentos crudos o poco cocidos. Sin embargo, la presencia de especies patógenas de Arcobacter en alimentos de origen marino y vegetales ha sido muy poco estudiada.

Cuando la detección e identificación de Arcobacter, se establece exclusivamente en función de métodos convencionales de cultivo, el proceso resulta lento, tedioso y poco efectivo en muchas ocasiones, originando frecuentes falsos negativos. Los métodos de detección molecular basados en el análisis de ácidos nucleicos, como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), pueden suponer una alternativa más rápida, sensible y fiable. Por todo ello, en este trabajo se ha realizado la detección de Arcobacter spp. mediante aislamiento por cultivo en placa y PCR, a partir de 100 muestras de moluscos y 100 de verduras. Los resultados obtenidos por ambos métodos confirman la existencia de Arcobacter en las muestras. La PCR, realizada tras un periodo de enriquecimiento, ha resultado ser más sensible que el cultivo para la detección del microorganismo en las muestras. En este trabajo se ha detectado contaminación por Arcobacter en el 71 % de las muestras de moluscos y el 20 % de las muestras de verduras.

Los aislados de Arcobacter obtenidos han sido identificados a nivel de especie mediante un análisis PCR-RFLP del gen 16 ARNr. Esta técnica ha permitido identificar las especies A. butzleri, A. cryaerophilus y A. defluvii de los aislados de moluscos, siendo la primera vez que es identificada A. defluvii de muestras de almejas. También es la primera vez que se detecta Arcobacter spp. en berberechos. En el caso de las verduras, se han aislado A. butzleri y A. cryaerophilus. Esta última especie ha sido identificada por primera vez en este tipo de muestras.

También se ha estudiado la sensibilidad de los aislados obtenidos a ciprofloxacino y levofloxacino. El porcentaje de muestras contaminadas con cepas resistentes fue del 2 % en moluscos y del 1 % en verduras. Tres aislados procedentes de moluscos y 2 de verduras, identificados previamente como A. butzleri, han mostrado resistencia a ambas fluoroquinolonas. En todos ellos se ha detectado la existencia de una mutación en la posición 254 (C normal por T mutante) en la Región Determinante de Resistencia a Quinolonas (QRDR) del gen gyrA. Nuestros resultados sobre la presencia del patógeno en ambos tipos de muestras son lo suficientemente relevantes como para considerar que el consumo de estos alimentos contaminados con Arcobacter, especialmente A. butzleri, podría suponer un riesgo para la salud humana.

Adicionalmente, en este trabajo se ha realizado un análisis de detección de Helicobacter spp. y H. pylori mediante PCR convencional y PCR a tiempo real. El género Helicobacter comprende un gran número de especies consideradas patógenas. La especie más estudiada es H. pylori, uno de los patógenos más comunes en humanos, responsable del 90 % de las úlceras pépticas y relacionado estrechamente con el desarrollo de cáncer gástrico. Aunque parece claro que H. pylori se transmite por la vía fecal-oral a través del agua, su presencia en los alimentos es poco conocida. Por lo tanto, en este estudio se tomó como objetivo estudiar la presencia de estos microorganismos en las muestras de moluscos y verduras. El análisis mediante PCR convencional no mostró resultados positivos para la detección de Helicobacter spp. ni H. pylori. La técnica PCR a tiempo real, sin embargo, ha permitido la detección de H. pylori en una muestra procedente de verduras (lechuga).

Els bacteris del gènere Arcobacter són microorganismes pertanyents a la família Campylobacteraceae. Actualment, el gènere Arcobacter comprèn 23 espècies, aïllades d'una gran diversitat d'hostes i nínxols ecològics. Les aigües de la mar són considerades l'hàbitat natural per a moltes d'aquestes espècies, encara que la major part de les patògenes són d'origen fecal. La transmissió a l'home sembla estar associada al consum d'aliments crus o poc cuits. No obstant això, la presència d'espècies patògenes d'Arcobacter en aliments d'origen marí i vegetals ha sigut molt poc estudiada.

Quan la detecció i identificació d'Arcobacter s'estableix exclusivament en funció de mètodes convencionals de cultiu, el procés resulta lent, tediós i sovint poc efectiu, i origina amb freqüència falsos negatius. Els mètodes de detecció molecular basats en l'anàlisi d'àcids nucleics, com la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), poden suposar una alternativa més ràpida, sensible i fiable. Per tot això, en aquest treball s'ha realitzat la detecció d'Arcobacter spp. mitjançant aïllament per cultiu en placa i PCR, a partir de 100 mostres de mol·luscos i 100 de verdures. Els resultats obtinguts pels dos mètodes confirmen l'existència d'Arcobacter en les mostres. La PCR, després d'un període d'enriquiment, ha resultat ser més sensible que el cultiu per a la detecció del microorganisme en mostres de mol·luscos. En aquest treball, s'ha detectat contaminació per Arcobacter en el 71 % de les mostres de mol·luscos i el 20 % de les mostres de verdures.

Els aïllats d'Arcobacter obtinguts han sigut identificats a nivell d'espècie mitjançant una anàlisi PCR-RFLP del gen 16 ARNr. Aquesta tècnica ha permès identificar les espècies A. butzleri, A. cryaerophilus i A. defluvii en els aïllats de mol·luscos. Aquesta és la primera vegada que A. defluvii és identificada en mostres de cloïsses. També és la primera vegada que es detecta Arcobacter spp. en catxels. En el cas de les verdures, s'han aïllat A. butzleri i A. cryaerophilus. Aquesta última espècie ha sigut identificada per primera vegada en aquest tipus de mostres.

També s'ha estudiat la sensibilitat dels aïllats obtinguts a la ciprofloxacina i la levofloxacina. El percentatge de mostres contaminades amb soques resistents va ser del 2 % en mol·luscos i de l'1 % en verdures. 3 aïllats procedents de mol·luscos i 2 de verdures, identificats prèviament com A. butzleri, han mostrat resistència a ambdues fluoroquinolones. En tots aquests s'ha detectat l'existència d'una mutació en la posició 254 (C normal per T mutant) en la regió determinant de resistència a quinolones (QRDR) del gen gyrA. Els nostres resultats sobre la presència del patogen en els dos tipus de mostres són prou rellevants per a considerar que el consum d'aquests aliments contaminats amb Arcobacter, especialment A. butzleri, podria suposar un risc per a la salut humana.

Addicionalment, en aquest treball s'ha fet una anàlisi de detecció d'Helicobacter spp. i H. pylori mitjançant PCR convencional i PCR a temps real. El gènere Helicobacter comprèn un gran nombre d'espècies considerades patògenes. L'espècie més estudiada és H. pylori, un dels patògens més comuns en humans, responsable del 90% de les úlceres pèptiques i relacionada estretament amb el desenvolupament de càncer gàstric. Encara que sembla clar que H. pylori es transmet per la via fecal-oral a través de l'aigua, la presència d'aquest bacteri en els aliments és poc coneguda. Per tant, en aquest estudi es va definir com a objectiu estudiar la presència d'aquests microorganismes en les mostres de mol·luscos i verdures. L'anàlisi mitjançant PCR convencional no va mostrar resultats positius per a la detecció d'Helicobacter spp. ni d'H. pylori. La tècnica PCR a temps real, en canvi, ha permès la detecció d'H. pylori en una mostra procedent de verdures (encisam).