Determinación del splicing de mini-genes SMN humanos en Drosophila melanogaster

Abstract

[EN] Spinal muscular atrophy (SMA) is a human disease characterized by motor neuron dysfunction and muscle deterioration due to reduced levels of the “Survival of Motor Neuron” (SMN) protein. Two paralogous genes, SMN1 and SMN2, encode this protein. SMN1 copy is mutated or deleted, which is responsible for SMA, while mutations in SMN2 do not have clinical consequences. The substitution of a single nucleotide in exon 7 in SMN2 causes changes in splicing which results in the exclusion of that exon. 90% of SMN2 transcripts

encode incomplete protein and only 10% give the functional form. This explains why SMN2 cannot compensate for the loss of SMN1 gene because it does not produce sufficient amount of full-length mRNA. Transgenic lines of Drosophila melanogaster expressing human SMN mini-genes (using the Gal4/UAS system) sequences ranging from exon 6 of SMN1 and SMN2 until exon 8, which is fused with luciferase were used to monitor the exon 7 splicing of SMN in different neurons: cholinergic, dopaminergic, serotonergic, glutamatergic and GABAergic. The study was conducted in neurons because those cells are the first to be affected when there is a deficiency of SMN protein. It was observed that flies expressing the SMN2 mini-gene had transcripts that skipped exon 7, as occurs in unaffected humans. All samples showed the same splicing pattern. However, changes were seen in the ratio (in percentage) of transcripts with or without exon 7. Sensory neurons (sensory), which are cholinergic, showed the highest percentage of exon 7 exclusion. These neurons, according to previous work, appear to be the primary cause of the dysfunction. Finally, it was observed that some of the samples had a large amount of isoforms with intron 7 it means that the splicing machinery in these neurons and in the fly model acts more slow, this delay might favor inclusion / exclusion of exon 7. These results demonstrate that the SMN2 splicing, in an insect neuronal context, is also affected by a single change in exon 7 sequence.

[ES] La atrofia muscular espinal (SMA) es una enfermedad humana caracterizada por la disfunción de las neuronas motoras y el deterioro muscular debido a la reducción de la proteína S u r viv al o f M o t o r N e u r o n (SMN). Esta proteína está codificada por dos genes parálogos, SMN1 y SMN2. La copia SMN1 es la responsable de la SMA ya que es la que se encuentra mutada o delecionada, mientras que las mutaciones en SMN2 no tienen consecuencias clínicas. El cambio de un solo nucleótido en el exón 7 en SMN2 provoca cambios en el splicing lo que da como resultado la exclusión de dicho exón. El 90% de los transcritos de SMN2 dan la proteína incompleta y sólo el 10% dan la forma funcional. Esto explica por qué SMN2 no puede compensar la pérdida del gen SMN1, ya que no produce cantidades normales del mRNA de SMN de longitud completa. Se utilizaron líneas transgénicas de Drosophila melanogaster que expresan mini-genes SMN humanos (mediante el sistema Gal4/UAS), que abarcan desde las secuencias del exón 6 de SMN1 y SMN2 al exón 8, este último fusionado con luciferasa, para supervisar el splicing del exón 7 de SMN en diferentes neuronas: colinérgicas, dopaminérgicas, serotoninérgicas, glutamatérgicas y GABAérgicas. El estudio se realizó en neuronas ya que estas células son las primeras en verse afectadas cuando hay una deficiencia de la proteína SMN. Se observó que las moscas que expresaban el mini-gen SMN2 presentaban transcritos con exclusión del exón 7, como ocurre en humanos no afectados por la enfermedad, y todas las muestras presentaron el mismo patrón de splicing . No obstante, se vieron cambios en el ratio (en porcentaje) de transcritos con y sin exón 7. Las neuronas sensoriales (sensory), que son colinérgicas, fueron las que más porcentaje de exclusión mostraron. Estas neuronas, según los trabajos previos, parece que son la causa primaria de la disfunción. Por último, se observó que algunas de las muestras presentaban una gran cantidad de transcritos con intrón 7 lo que podría significar que la maquinaria de splicing en estas neuronas y en este sistema modelo actúa de una forma más lenta o menos eficaz procesando este intrón. Estos resultados demuestran que el splicing de SMN2, en un contexto neuronal de insecto, se ve también afectado con un solo cambio en la secuencia del exón 7.