Caracterización de la glicosiltransferasa de tomate Twi1 y su papel en defensa frente a una infección viral

Abstract

Con el fin de hacer frente a ataques patogénicos de diversa naturaleza, las plantas presentan barreras físicas naturales y acumulan compuestos defensivos. Además, han desarrollado una serie de mecanismos inducibles, que se activan tras la entrada del patógeno, que conllevan la inducción o represión de ciertos genes, así como la producción de metabolitos implicados en defensa. Concretamente, los metabolitos secundarios de naturaleza fenólica juegan un papel muy importante en la respuesta defensiva (Dixon et al., 2002). Éstos pueden clasificarse en tres grupos: moléculas señal, capaces de activar dicha respuesta; fitoanticipinas, presentes en la planta de manera constitutiva o preformados y fitoalexinas, que se sintetizan de novo o ven incrementada su síntesis en respuesta a un ataque microbiano. En el laboratorio donde realizaré mi TFM, se estudia la función que desempeñan el ácido salicílico (SA) y el ácido gentísico (GA), compuestos fenólicos pertenecientes al grupo de moléculas señal, en la respuesta defensiva de las plantas (Bellés et al., 1999; Bellés et al., 2006; Zacarés et al., 2007; López-Gresa et al., 2011). Tanto el SA como el GA se acumulan en las plantas en respuesta a infecciones patogénicas, e inducen genes y proteínas de defensa PR (Pathogenesis-Related). Además, recientemente se ha observado que aplicaciones de estos compuestos en plantas de tomate inducen resistencia frente a infecciones virales y viroidales (Campos et al., 2014a). Para estudiar el papel del SA y del GA en la respuesta defensiva, una posible estrategia es la obtención y caracterización de plantas transgénicas que presenten niveles alterados de estos compuestos. Tanto SA como GA se acumulan en plantas en forma de glicósidos, es decir, conjugados a una molécula de azúcar, reacción catalizada por las proteínas glicosiltransferasas (GTs). Muchas de estas GTs se inducen tras la aplicación de SA. Concretamente, el gen de tomate Twi1 (Tomato wound induced 1), que codifica una posible GT de acuerdo con la homología que presenta con proteínas de esta familia, mostró inducción por herida, tratamientos con SA y otros fenólicos, así como por infecciones patogénicas (O Donnell et al., 1998). La caracterización de la función de Twi1 se está llevando a cabo en nuestro laboratorio. La sobreexpresión de la proteína en Nicotiana benthamiana y su purificación permitió el análisis de su actividad enzimática in vitro, mostrando actividad glucosiltransferasa frente a los ácidos 2,4-dihidroxibenzoico (2,4-DHBA) y 2,4,6-trihidroxibenzoico (2,4,6-THBA). Aplicaciones de estos polifenoles a plantas transgénicas de tomate que silencian Twi1 (RNAi Twi1) corroboraron su actividad in vivo, pues estas plantas mostraron un menor porcentaje de conjugación de 2,4-DHBA y 2,4,6-THBA y, por consiguiente, una mayor acumulación de ambos metabolitos en su forma libre (Campos L, 2014). El objetivo principal de mi Trabajo consiste en caracterizar la respuesta de plantas transgénicas RNAi Twi1 frente a la infección con el virus del bronceado del tomate (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV). Para ello, se estudiará la posible resistencia o susceptibilidad frente a la infección atendiendo a la sintomatología, se cuantificará la acumulación de las formas libres y conjugadas de los metabolitos sustrato de Twi1, y/o de otros compuestos que participen en su ruta de biosíntesis, y se analizará la expresión de diferentes genes implicados en defensa. Los metabolitos secundarios juegan un papel muy importante en el sistema defensivo de las plantas, no sólo formando parte de la respuesta final frente al patógeno, sino actuando como moléculas señal y/o compuestos intermediarios. Por ello, la generación de plantas transgénicas que presenten niveles alterados de metabolitos constituye una herramienta muy útil a la hora de profundizar en el estudio de la función que desempeñan en el complejo sistema defensivo de las plantas

[ES] Con el fin de hacer frente a ataques patogénicos de diversa naturaleza, las plantas presentan barreras físicas naturales y acumulan compuestos defensivos. Además, han desarrollado una serie de mecanismos inducibles, que se activan tras la entrada del patógeno, que conllevan la inducción o represión de ciertos genes, así como la producción de metabolitos implicados en defensa. Concretamente, los metabolitos secundarios de naturaleza fenólica juegan un papel muy importante en la respuesta defensiva (Dixon et al., 2002). Éstos pueden clasificarse en tres grupos: moléculas señal, capaces de activar dicha respuesta; fitoanticipinas, presentes en la planta de manera constitutiva o preformados y fitoalexinas, que se sintetizan de novo o ven incrementada su síntesis en respuesta a un ataque microbiano. En el laboratorio donde realizaré mi TFM, se estudia la función que desempeñan el ácido salicílico (SA) y el ácido gentísico (GA), compuestos fenólicos pertenecientes al grupo de moléculas señal, en la respuesta defensiva de las plantas (Bellés et al., 1999; Bellés et al., 2006; Zacarés et al., 2007; López-Gresa et al., 2011). Tanto el SA como el GA se acumulan en las plantas en respuesta a infecciones patogénicas, e inducen genes y proteínas de defensa PR (Pathogenesis-Related). Además, recientemente se ha observado que aplicaciones de estos compuestos en plantas de tomate inducen resistencia frente a infecciones virales y viroidales (Campos et al., 2014a). Para estudiar el papel del SA y del GA en la respuesta defensiva, una posible estrategia es la obtención y caracterización de plantas transgénicas que presenten niveles alterados de estos compuestos. Tanto SA como GA se acumulan en plantas en forma de glicósidos, es decir, conjugados a una molécula de azúcar, reacción catalizada por las proteínas glicosiltransferasas (GTs). Muchas de estas GTs se inducen tras la aplicación de SA. Concretamente, el gen de tomate Twi1 (Tomato wound induced 1), que codifica una posible GT de acuerdo con la homología que presenta con proteínas de esta familia, mostró inducción por herida, tratamientos con SA y otros fenólicos, así como por infecciones patogénicas (O Donnell et al., 1998). La caracterización de la función de Twi1 se está llevando a cabo en nuestro laboratorio. La sobreexpresión de la proteína en Nicotiana benthamiana y su purificación permitió el análisis de su actividad enzimática in vitro, mostrando actividad glucosiltransferasa frente a los ácidos 2,4-dihidroxibenzoico (2,4-DHBA) y 2,4,6-trihidroxibenzoico (2,4,6-THBA). Aplicaciones de estos polifenoles a plantas transgénicas de tomate que silencian Twi1 (RNAi Twi1) corroboraron su actividad in vivo, pues estas plantas mostraron un menor porcentaje de conjugación de 2,4-DHBA y 2,4,6-THBA y, por consiguiente, una mayor acumulación de ambos metabolitos en su forma libre (Campos L, 2014). El objetivo principal de mi Trabajo consiste en caracterizar la respuesta de plantas transgénicas RNAi Twi1 frente a la infección con el virus del bronceado del tomate (Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV). Para ello, se estudiará la posible resistencia o susceptibilidad frente a la infección atendiendo a la sintomatología, se cuantificará la acumulación de las formas libres y conjugadas de los metabolitos sustrato de Twi1, y/o de otros compuestos que participen en su ruta de biosíntesis, y se analizará la expresión de diferentes genes implicados en defensa. Los metabolitos secundarios juegan un papel muy importante en el sistema defensivo de las plantas, no sólo formando parte de la respuesta final frente al patógeno, sino actuando como moléculas señal y/o compuestos intermediarios. Por ello, la generación de plantas transgénicas que presenten niveles alterados de metabolitos constituye una herramienta muy útil a la hora de profundizar en el estudio de la función que desempeñan en el complejo sistema defensivo de las plantas