Identificación y caracterización de mutantes afectados en el desarrollo temprano en líneas T-DNA de tomate y de Solanum pimpinellifolium

Abstract

[EN] ix Abstract The Knowledge of key genes that affect the developm ent of plants and interaction with external agents is a determining factor, both from an applied and a basic point of view. Among the strategies to identify these genes, the i dentification and characterization of mutants for these characters is among those which h ave most reported success. Insertional mutagenesis has a key advantage compare d to other mutagenic agents, as the mutated gene is tagged by the T-DNA, which has a kn own sequence. In this work, the plant tissue culture has been use d as a tool for the detection of affected mutants in the early development of plants and for their subsequent characterization. We have worked with a collection of 110 T-DNA lines from Solanum pimpinellifolium and 13 T-DNA lines from Solanum lycopersicum (Money Maker variety) transformed with an intensifier trap. For this purpose, both th e medium and the techniques expected from the plant tissue culture and the culture in gr eenhouses have been used as method of corroboration of some mutant phenotypes. Thanks to this work seven mutants T-DNA lines have been detected, two of S. pimpinellifolium and five of tomato affected in diverse characters a s: compactness, floral development, chlorosis, adventitious regener ation and rooting, among others. In these mutants the phenotypic characterization and t he genetic analysis as well as the presence of cosegregation between a T-DNA insert an d the mutant phenotype have been carried out. The final objective for each mutant is to identify the affected gene as well as to know the biological processes in which that gene intervenes.

[ES] La deteccción de mutantes con alguna alteración en el desarrollo temprano de la planta (e.g. desarrollo radicular y del ápice meristemático) o en la capacidad de regeneración adventicia es la mejor estrategia para identificar los genes que controlan estos caracteres. Entre las alternativas posibles para generar mutantes (e.g. radiaciones, productos químicos como EMS, etc.), la mutagénesis insercional es la más adecuada para abordar este objetivo. Con esta estrategia, tras la obtención de un gran número de plantas transgénicas, se evalúa su fenotipo para poder detectar alteraciones causadas por la integración del T-DNA. Si se produce la disrupción de un gen endógeno se suele obtener un mutante de anulación de función, mientras que la inserción del T-DNA en una región de control o en la vecindad del mismo puede provocar una alteración de su nivel de expresión. En cualquier caso, como el gen endógeno queda etiquetado por el T-DNA, se puede llegar a la clonación del gen mediante métodos basados en la PCR (e.g. Anchor- o Tail-PCR) y obtener una valiosa información sobre el papel de ese gen en el carácter evaluado. El desarrollo de un protocolo eficaz de transformación genética en tomate y especies silvestres relacionadas (Solanum pimpinellifolium, S. pennellii, S. cheesmaniae) ha permitido la obtención de más de 7.000 líneas T-DNA en el contexto de varios proyectos. Se ha realizado el escrutinio de estas colecciones de líneas T-DNA para identificar mutantes alterados en caracteres del desarrollo vegetativo y reproductivo, así como en el nivel de tolerancia a estreses abióticos, principalmente salinidad y sequía. La frecuencia de mutantes (dominantes o recesivos) para los caracteres evaluados está en torno al 10 % y los análisis Southern revelan que el número medio de insertos por línea es moderado (1.7), lo que facilita la identificación del inserto de T-DNA que genera el fenotipo mutante. En el marco de estos proyectos, se ha conseguido la identificación de varios genes a partir de mutantes seleccionados para diversos caracteres. En el presente TFM lo que planteamos es la identificación y caracterización de mutantes alterados en la respuesta morfogenética in vitro, así como en caracteres del desarrollo temprano de la planta (enraizamiento y desarrollo del ápice meristemático) mediante el escrutinio de líneas T-DNA. En este marco general, los objetivos concretos del proyecto son los siguientes: 1) Identificación de mutantes de tomate y de S. pimpinellifolium con alteraciones en caracteres del desarrollo temprano y/o con cambios en la respuesta morfogenética in vitro. 2) Caracterización de los mutantes que identifiquemos, así como de otros previamente seleccionados.