Ploidy manipulation for genetic improvement in some Mediterranean fruit crops

Abstract

Plant breeding is focused on selection of new genotypes with improved traits. Conventional methods based on hybridization and those based on biotechnology (somatic hybridization, genetic transformation, ploidy manipulation, etc.) are used to create novel genetic variations. Biotechnology provides powerful tools for plant breeding, for instance, haploid technology allows achievement of homozygous lines from heterozygous parents in one step, which reduces significantly the time required by conventional methods. Concerning woody species, characterized by self-incompatibility, long juvenile period and high degree of heterozygosity, this technique is the only way to get homozygous lines. Haploid plants are of great interest for breeding and genomic studies, being used in mutation research, genetic analysis, genome mapping and gene transfer. Gametic embryogenesis, based on cellular totipotency, produces an embryo from an immature gamete, by switching its developmental pathway from gametophytic to sporophytic. This research is focused on inducing gametic embryogenesis in two important Mediterranean fruit crops: almond (Prunus dulcis Mill.) via in vitro anther culture and mandarin (Citrus reticulata Blanco) via isolation and microspore culture. Also ploidy manipulation was applied to loquat (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) for getting genotypes whit different ploidy levels. The experiments were carried out through years 2014, 2015 and 2016 at the 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) as well as at the 'Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias' (IVIA). Regarding the almond anther culture, formation of calli and production of embryos was achieved through the direct embryogenesis route. On then other hand, early embryo regeneration is reported, for the first time, from isolated microspore culture of mandarin, 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Our results report the evidence of gametic embryogenesis and the production of homozygous regenerants in almond and mandarin, two species extremely recalcitrant to microspore embryogenesis. However, the results are affected by many factors that need further studies to better understand the embryogenic development and to increase the rate of embryo achievement. Moreover, another biotechnological tool (ploidy manipulation) was also applied for implementing the IVIA loquat breeding program. Polyploid plants are of great interest in this species, due to its potential for producing seedless genotypes via direct use of triploids or crosses between tetra and diploids. Aimed at obtaining new loquat genotypes, with different ploidy levels (polyploids), colchicine was applied to seeds before germination, to induce chromosome duplication. A total of three triploids (3x) and one tetraploid (4x) were obtained.

La mejora genética tiene como objetivo la selección de nuevos genotipos con mejores características. Los métodos de mejora convencional basados en hibridaciones y aquellos basados en Biotecnología (hibridación somática, transformación genética, manipulación de la ploidía, etc.) se utilizan para obtener nueva variación genética. La Biotecnología proporciona herramientas poderosas en mejora genética, por ejemplo, la obtención de haploides permite obtener líneas homocigotas en un solo paso, disminuyendo significativamente el tiempo requerido usando métodos convencionales. Respecto a especies leñosas, caracterizadas por autoincompatibilidad floral, largo período juvenil y alto grado de heterocigosidad, esta técnica es el único método de obtención de líneas homocigotas. Los genotipos haploides tienen un alto interés en estudios genómicos, siendo utilizados en estudios de mutaciones, análisis genéticos, mapeo genético y transferencia genética. Este estudio tiene como objetivo la inducción de embriogénesis gamética en dos especies mediterráneas muy importantes: el almendro (Prunus dulcis Mill.) por medio de cultivo in vitro de anteras y el mandarino (Citrus reticulata Blanco) por medio de aislamiento de microesporas. Además, se ha estudiado la obtención de poliploides en níspero (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) con el objetivo de obtener genotipos con diversos niveles de ploidía. Los experimentos se llevaron a cabo en los años 2014, 2015 y 2016 en la 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) y en el 'Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias' (IVIA). Respecto al cultivo de anteras en almendro, la formación de callos y producción de embriones se obtuvo mediante embriogénesis directa. Por otro lado, se ha conseguido regenerar por primera vez embriones a partir de microesporas aisladas en el cultivar de mandarino 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Los resultados obtenidos muestran que la embriogénesis gamética y la regeneración de embriones homocigótos en almendro y mandarino, dos especies extremadamente recalcitrantes para la embriogenésis a partir de microesporas, es posible. Sin embargo, los resultados se ven afectados por muchos factores que necesitan estudios adicionales para comprender mejor el desarrollo embriogénico y para aumentar la tasa de obtención del embriones. Además, otra herramienta biotecnológica (manipulación de la ploidía) se aplicó con el objetivo de implementar el programa de mejora de níspero del IVIA. Las plantas poliploides en esta especie tienen un alto interés, pues podrían permitir la obtención de frutos sin semilla, por medio de la obtención directa de triploides o mediante cruzamiento entre tetraploides y diploides. Con el objetivo de obtener nuevos genotipos de níspero con diferentes niveles de ploidía (poliploides), se aplicó colchicina a semillas sin germinar con el fin de inducir la duplicación cromosómica y se obtuvieron 3 triploides (3x) y un tetraploide (4x).

La millora genètica té com objectiu la selecció de nous genotips amb millors característiques. Els mètodes de millora convencional basats en hibridacions i aquells basats en Biotecnologia (hibridació somàtica, transformació genètica, manipulació de la ploïdia, etc.) s'utilitzen per aconseguir nova variació genètica. La Biotecnologia proporciona eines poderoses en millora genètica, per exemple, l'obtenció d'haploides permet obtenir línies homozigòtiques en un sol pas, disminuint significativament el temps requerit usant mètodes convencionals. Pel que fa a espècies llenyoses, caracteritzades per autoincompatibilitat floral, llarg període juvenil i alt grau d'heterozigosi, aquesta tècnica és l'únic mètode d'obtenció de línies homozigòtiques. Els genotips haploides tenen un alt interès en estudis genòmics, sent utilitzats en estudis de mutacions, anàlisis genètics, mapatge genètic i transferència genètica. Aquest estudi té com objectiu la inducció d'embriogènesi gamètica en dos espècies mediterrànies molt importants: l'ametller (Prunus dulcis Mill.) a través del cultiu in vitro d'anteres i el mandariner (Citrus reticulata Blanco) per mitjà d'aïllament de micròspores. A més a més, s'ha estudiat l'obtenció de poliploides en nespra (Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl.) Amb l'objectiu d'aconseguir genotips amb diversos nivells de ploïdia. Els experiments es van dur a terme en els anys 2014, 2015 i 2016 a la 'Università degli Studi di Palermo' (UNIPA) i a 'l'Institut Valencià d'Investigacions Agràries' (IVIA). Respecte al cultiu d'anteres en ametller, la formació de calls i producció d'embrions es va obtenir mitjançant embriogènesi directa. D'altra banda, s'ha aconseguit per primera vegada la regeneració d'embrions a partir de micròspores aïllades en el conrear de mandariner 'Mandarino Tardivo di Ciaculli'. Els resultats obtinguts mostren que l'embriogènesi gamètica i la regeneració d'embrions homozigotics en ametller i mandariner, dues espècies extremadament recalcitrants per l'embriogènesi a partir de micròspores, és possible. No obstant això, els resultats es veuen afectats per molts factors que necessiten estudis addicionals per entendre millor el desenvolupament embriogènic i per augmentar la taxa d'obtenció dels embrions. A més, una altra eina biotecnològica (manipulació de la ploïdia) es va aplicar amb l'objectiu d'implementar el programa de millora de nespra de l'IVIA. Les plantes poliploides en aquesta espècie tenen un alt interès, ja que podrien permetre l'obtenció de fruits sense llavor, per mitjà de l'obtenció directa de triploides o mitjançant encreuament entre tetraploides i diploides. Amb l'objectiu d'aconseguir nous genotips de nespra amb diferents nivells de ploïdia (poliploides), es va aplicar colquicina a llavors sense germinar per tal d'induir la duplicació cromosòmica i es van obtenir 3 triploides (3x) i un tetraploide (4x).