Elucidating the molecular basis of copper stress in Erwinia amylovora

Abstract

Erwinia amylovora, a quarantine organism of the European Union (EU), is the causal agent of fire blight. This disease causes substantial economic losses in all countries where it is present and its control turns out difficult, due to the absence of effective chemical and biological treatments and the ability of persistence and dissemination of E. amylovora. Cupric treatments constitute the base of the integrated management of fire blight in the European Union countries, because the antibiotics, although have been proved useful against this disease, are forbidden in the EU for plant treatments. This thesis, mostly performed in a P2 security lab, is aimed to dilucidate molecular mechanisms implicated in the response of E. amylovora to copper sulfate as a stress factor, considering that copper is a well known toxic element for bacterial cells over a certain threshold concentration. The global objective was first addressed with the study of a selection of genes that have been related in other bacterial models with copper stress or with stress in general. The quantification of the rpoS gene expression in presence of copper showed that, at least in long-term survival, this gene may be involved in the E. amylovora response to copper stress. Second, a transcriptomic study was performed by microarray after subdue the bacteria to a copper shock treatment. The analysis of the microarray results showed that 44 genes were differentially expressed in presence of this metal. Each one of these genes was studied by gene ontology and, after comparing them with databases published in NCBI, they were classified in functional categories. The gene expression of twenty-five out of fourty-four differentially expressed genes was validated by real-time PCR. In the validation, copA gene was expressed more than 19-fold in presence than in absence of copper and, because of that, it was selected together with other seven genes (soxS, yjcE, ygcF, yhhQ, galF, arcB, EAM_3469), which also showed an increased expression, to generate mutants of E. amylovora. The responses of mutants to copper, and the fact that the wild phenotype was restored in the complemented mutants, has shown the role of copA, soxS, yjcE, ygcF, arcB and yhhQ genes in the E. amylovora in vitro survival against copper stress. Besides, the implication of copA gene has also been proved in planta, in copper treated shoots from pear trees. Finally, all the results obtained along this thesis have allowed to elaborate a putative model of the different genetic mechanisms that seem are involved in the interaction between E. amylovora and copper. The most important mechanism seems to be to face up reactive oxygen species (ROS) by the activation of the soxS and yjcE genes. The activity of these genes is supported by CopA protein, which pumps copper from inside the cell out to the periplasmic space. The activation of arcB gene, which allows the change from aerobic metabolism to anaerobic metabolism, would also help E. amylovora to reduce ROS. Taking together, the results of this thesis have allowed an approximation to the genetic basis of E. amylovora response to copper stress and they constitute a start point to move forward in the knowledge of the molecular mechanisms underlying that response.

Erwinia amylovora, organismo de cuarentena en la Unión Europea (UE), es el agente causal del fuego bacteriano. Esta enfermedad produce grandes pérdidas económicas en todos los países en los que está presente y su control resulta muy difícil, debido a la carencia de tratamientos químicos y biológicos eficaces y a la persistencia y facilidad de diseminación de E. amylovora. Los tratamientos con compuestos cúpricos constituyen la base de la gestión integrada del fuego bacteriano en los países de la UE, puesto que el uso de antibióticos, aunque se ha demostrado útil contra esta enfermedad, está prohibido en la UE para el tratamiento de bacteriosis en plantas. Esta tesis, realizada en su mayoría en un laboratorio de seguridad biológica P2, pretende dilucidar mecanismos moleculares implicados en la respuesta de E. amylovora al sulfato de cobre como factor de estrés, ya que este metal es un elemento tóxico para las células bacterianas por encima de una determinada concentración umbral. El objetivo global se abordó, en primer lugar, con el estudio de una selección de genes que se han relacionado en otros modelos bacterianos con el estrés que produce el cobre o con el estrés en general. La cuantificación de la expresión del gen rpoS en presencia de cobre mostró que este gen puede estar implicado en la supervivencia a largo plazo de E. amylovora para combatir el estrés que produce este metal. En una segunda aproximación, se realizó un estudio transcriptómico mediante microarray tras someter a la bacteria a un breve tratamiento de cobre. El análisis de los resultados del microarray reveló que 44 genes se expresaban de forma diferencial en presencia del metal. Cada uno de ellos se estudió mediante gene ontology y por comparación con las bases de datos publicadas en el NCBI, y así se clasificaron en categorías funcionales. Las categorías de estrés y transporte fueron las más abundantes, tanto respecto a los genes que aumentaron su expresión tras la aplicación de cobre como a los que la disminuyeron. De los 44 genes que se expresaron de forma diferencial, se validó la expresión de 25 de ellos por PCR en tiempo real. En dicha validación, el gen copA se expresó 19 veces más en presencia que en ausencia de cobre, por lo que fue seleccionado, junto con siete genes más (soxS, yjcE, ygcF, yhhQ, galF, arcB, EAM_3469), en los que el incremento en la expresión fue menos pronunciado, para generar mutantes de E. amylovora. La respuesta de los mutantes a la presencia de cobre, y la restauración de fenotipos al complementar las mutaciones generadas, han revelado el papel de los genes copA, soxS, yjcE, ygcF, arcB y yhhQ en la supervivencia in vitro de E. amylovora frente al estrés por cobre. Además, la implicación del gen copA se ha demostrado también in planta en brotes de peral tratados con cobre. Finalmente, todos los resultados obtenidos han permitido elaborar un posible modelo de los diferentes mecanismos genéticos que parecen estar implicados en la interacción de E. amylovora con el cobre. El mecanismo más importante parece ser combatir las especies reactivas del oxígeno (ERO), mediante la activación de la expresión de los genes soxS e yjcE. La actividad de estos genes está apoyada, además, por la proteína CopA, que bombea cobre desde el interior celular al espacio periplásmico. La activación del gen arcB, que permite el cambio de un metabolismo aerobio a uno anaerobio, también ayudaría a la reducción de las ERO. En definitiva, los resultados han permitido una aproximación al sustrato genético de la respuesta de E. amylovora al estrés por cobre, y constituyen un punto de partida para avanzar en el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en dicha respuesta.

E. amylovora, organisme de quarantena a la Unió Europea (UE), és l'agent causal del foc bacterià. Aquesta malaltia produeix grans pèrdues econòmiques a tots els països on està present, i el seu control resulta molt difícil, a causa de l' absència de productes químics i biològics eficaços i també per la capacitat de persistència i disseminació d'E. amylovora. Els tractaments amb composts cúprics constitueixen la base de la gestió integrada del foc bacterià als països europeus, ja que l'ús d'antibiòtics, tot i que s'ha demostrat eficaç per a combatre aquesta malaltía, està prohibit a la UE per al tractament de bacteriosi en plantes. Aquesta tesi, realitzada majoritàriament a un laboratori de seguretat biològica P2, pretén dilucidar mecanismes moleculars implicats en la resposta d'E. amylovora davant del coure com a factor d'estrés, ja que el coure és un element tòxic per la cèl.lula per damunt d'una determinada concentració umbral. L'objectiu global es va abordar, en primer lloc, amb l'estudi d'una selecció de gens relacionats en altres models bacterians amb l'estrés que produeix el coure, o amb l'estrés en general. La quantificació de l'expressió del gen rpoS en presència de coure va mostrar que aquest gen pot estar implicat en la supervivència a llarg termini d'E. amylovora per a combatre l'estrés que produeix aquest metall. En una segona aproximació, es va realitzar un estudi transcriptòmic mitjançant microarrays després de sotmetre els bacteris a un breu tractament de coure. L'anàlisi dels resultats dels microarrays va revelar que 44 gens s'expressen de forma diferencial en presència del metall. Cadascun d'ells es va estudiar mitjançant gene ontology i, per comparació amb les bases de dades publicades al NCBI, es van classificar en categories funcionals. Les categories d'estrés i transport van ser les més enriquides, tant en els gens que augmentaren la seua expressió després de l'aplicació de coure com en aquells que la van reduir. Dels 44 gens que s'expressaren de forma diferencial, es va validar l'expressió de 25 d'ells per PCR a temps real. En la validació, el gen copA es va expressar 19 vegades més en presència que en absència de coure, per aquesta raó va ser seleccionat junt amb set gens més (soxS, yjcE, ygcF, yhhQ, galF, arcB, EAM_3469), en els que l'increment de l'expressió va ser menys pronunciada, per a generar mutants d'E. amylovora. La resposta dels mutants a la presència de coure, i la restauració dels fenotips originals al complementar les mutacions generades, han revelat el paper dels gens copA, soxS, yjcE, ygcF, arcB i yhhQ en la supervivència in vitro d'E. amylovora davant a l'estrés per coure. A més a més, la implicació del gen copA s'ha demostrat també in planta, en brots de perera tractats amb coure. Finalment, tots els resultats obtinguts han permès elaborar un possible model dels diferents mecanismes genètics que semblen estar implicats en la interacció d'E. amylovora amb el coure. El mecanisme més important sembla ser combatre les especies reactives de l'oxigen (ERO), mitjançant l'activació de l'expressió dels gens soxS i yjcE. L'activitat d'aquestos gens és recolzada també per l'acció de la proteïna copA, que bombeja coure des de l'interior cel.lular a l'espai periplàsmic. L'activació del gen arcB, que permet el canvi d'un metabolisme aerobi a un metabolisme anaerobi, també ajudaria a reduir la producción de les ERO. En conclusió, els resultats han suposat una aproximació al substrat genètic de la resposta d'E. amylovora a l'estrés per coure, i constitueixen un punt de partida per avançar en el coneixement dels mecanismes moleculars implicats en aquesta resposta.