Mutagenesis insercional en tomate y Solanum pennellii: Identificación de mutantes en inserción alterados en el desarrollo y la tolerancia a la salinidad

Abstract

[EN] The knowledge of the key genes which crucially affect the development and stress tolerance of plants is a very important task and indispensable for both, the basic and the applied research. The screening of populations of mutagenized plants permits the identification of mutants and, starting with their analysis, the identification of the genes responsible for a certain trait. Compared to alternative methods (e.g. chemical or physical mutagens) the insertional mutagenesis using T-DNA offers the additional advantage of labeling the altered gene with a piece of known sequence that will facilitate its identification and cloning. On the other hand, the tomato is one of the world¿s economically most important vegetables which over the last few years also gained the status of a model organism for certain traits. In order to identify the relevant genes involved in the response of plants to abiotic stresses and processes related to the vegetative and reproductive development, our laboratory performs in collaboration with Dr. Lozano¿s (University of Almería) and Dr- Bolarín¿s (CEBAS-Murcia) groups a project of insertional mutagenesis in tomato and related wild species, among them Solanum pennellii. The present PhD-thesis is embedded in this context and aims to create a collection of transgenic plants of S. pennellii, design new methods helpful for evaluating the tolerance to salt stress, the identification of traits related to water or salt stress and screen several lines of S. lycopersicum which were pre-selected for showing different aberrations that could be related to the tolerance to abiotic stresses. By tackling these tasks it was possible to obtain the following results. After obtaining more than two thousand diploid transgenic lines of S. pennellii, 887 of them were screened with the different systems developed for detecting mutant plants. Two of the methods designed were based on in vitro culture and one for the short-term evaluation in vivo. With the latter one a total of 68 tomato lines were screened and among them a mutant with alterations in its development which could be interesting for its relation to abiotic stress tolerance identified. In the collection of S. pennellii several plants showing phenotypes with different alterations were detected. Three of them received an advanced examination and it was possible to identify and clone the affected gene in one case. The detected mutants as much as the developed technologies are of great value for deepening the understanding of the processes related to abiotic stress tolerance in a crop with the outstanding importance of the tomato.

[ES] El conocimiento de los genes clave que afectan al desarrollo de las plantas y su tolerancia a estreses abióticos es un aspecto muy importante, tanto desde un punto de vista básico como aplicado. El escrutinio de poblaciones de plantas mutagenizadas permite la identificación de mutantes y, a partir de ellos, conocer los genes responsables de un carácter concreto. Cuando se compara con otras alternativas metodológicas (mutágenos químicos o físicos) la mutagénesis insercional con T-DNA aporta una ventaja adicional, ya que si el gen queda etiquetado por un fragmento de ADN de secuencia conocida su identificación y clonación es más sencilla. Por otro lado, el tomate es una de las especies con mayor importancia económica a nivel mundial que, en los últimos tiempos, se ha considerado también como especie modelo para el estudio de determinados caracteres. Para lograr la identificación de genes clave en la respuesta de las plantas a los estreses de tipo abiótico y en procesos del desarrollo tanto vegetativo como reproductivo, en nuestro laboratorio se está abordando, en colaboración con los grupos del Dr. Lozano (Universidad de Almería) y de la Dra. Bolarín (CEBAS - Murcia), un proyecto de mutagénesis insercional con tomate y especies silvestres relacionadas, entre ellas Solanum pennellii. La tesis doctoral presente se enmarca en este contexto y tiene como objetivos la creación de una colección de plantas transgénicas de S. pennellii, el diseño de nuevos métodos aptos para evaluar la tolerancia al estrés salino, la identificación de caracteres relacionados con el estrés hídrico o salino y el escrutinio de algunas líneas de S. lycopersicum pre-seleccionadas por mostrar diferentes alteraciones que puedan estar relacionadas con la tolerancia a estreses de tipo abiótico. Tras abordar estos objetivos se han obtenido los siguientes resultados. Tras obtener más de dos mil líneas transgénicas diploides de Solanum pennellii se han evaluado 887 líneas con los diferentes sistemas de identificación de mutantes diseñados. Dos de los métodos de evaluación diseñados se basaron en el cultivo in vitro y uno en un sistema de cultivo in vivo a corto plazo. Además, con esta última metodología se evaluaron 68 líneas de tomate entre las que se identificó un mutante de desarrollo de elevado interés por su relación con la tolerancia a estreses abióticos. Entre las líneas de Solanum pennellii analizadas se han identificado fenotipos con distintas alteraciones. En tres de estas líneas se llevó a cabo una evaluación más avanzada llegando a identificar y clonar el gen afectado en una de ellas. Tanto los mutantes identificados como las metodologías desarrolladas son de gran valor para seguir profundizando en los procesos relacionados con la tolerancia a estreses abióticos en una especie tan importante como el tomate.

[CA] El coneixement dels gens clau que afecten al desenvolupament de les plantes i la seua tolerància a estressos abiòtics és un aspecte molt important, des d'un punt de vista bàsic com a aplicat. L'escrutini de poblacions mutagenitzades de plantes permet la identificació de mutants i a partir d'ells conèixer els gens d'un caràcter concret. Quan es compara amb altres alternatives metodològiques (mutàgens físics o químics) la mutagènesi amb T-DNA aporta un avantatge addicional, ja que al tindre el gen un fragment etiquetat pel T-DNA de seqüència coneguda la seua identificació i clonació és més senzilla. D'altra banda, la tomaca és una de las espècies de major importància econòmica a nivell mundial que, en els últims temps, s'ha considerat també una espècie model per a l'estudi de determinats caràcters. Per a aconseguir la identificació de gens clau en la resposta de les plantes a estressos abiòtics i processos de desenvolupament tant vegetatiu com reproductiu, en el nostre laboratori s'està abordant amb col·laboració amb els grups del Dr. Lozano (Universitat d'Almeria) i la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia), un projecte de mutagènesi insercional amb tomaca i espècies silvestres relacionades, entre elles Solanum pennellii. La tesi doctoral s'emmarca en aquest context i té com a objectius la creació d'una col·lecció de plantes transgèniques de Solanum pennellii, el disseny de nous mètodes aptes per a avaluar la tolerància a l'estrès salí, la identificació de caràcters relacionats amb l'estrès hídric i salí, l'escrutini d'algunes línies de S. lycopersicum pre-seleccionades per mostrar diferents alteracions que puguen estar relacionades amb la tolerància a estressos de tipus abiòtic. En abordar estos objectius s'han obtingut els següents resultats. Després d'obtindre més de dos mil línies transgèniques diploides de Solanum pennellii s'han avaluat 821 línies amb els diferents sistemes d'identificació de mutants dissenyats. Dos dels mètodes d'avaluació dissenyats es basaren en el cultiu in vitro i un en un sistema de cultiu in vivo a curt termini. A més, amb aquesta última metodologia s'avaluaren 68 línies de tomaca entre les quals s'identificà un mutant de desenvolupament d'elevat interès per la seua relació amb la tolerància a estressos abiòtics. Entre les línies de Solanum pennellii analitzades s'han identificat fenotipus amb diferents alteracions. En tres d'estes línies es va dura a terme una avaluació més avançada arribant a identificar el gen afectat en una de les línies. Tant els mutants identificats com les metodologies desenvolupades són de gran valor per a seguir aprofundint en els processos relacionats amb la tolerància a estressos abiòtics en una espècie tan important como la tomaca.