Biotechnological routes for the development of antimicrobial nano-metal based polyhydroxyalkanoates for active food packaging applications

Abstract

The development of novel bio-based materials with antimicrobial properties for active packaging applications is a topic of significant interest. The current PhD thesis deals with the development of biotechnologically derived polyhydroxyalkanoates (PHAs) based on nanometals for antimicrobial active food packaging applications. Initially, silver nanoparticles (AgNPs) were produced by chemical reduction and stabilized in situ within unpurified poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate), PHBV18 (18 mol% valerate) suspensions previously obtained from mixed microbial cultures. The stabilized AgNPs were subsequently used to develop PHAs-AgNPs nanocomposites following two different strategies: 1) a direct melt-blending process where the AgNPs were added to the PHBV3 (3% mol valerate) from a highly dispersed and distributed enriched masterbatch form and, 2) as an annealed electrospun coating of PHBV3/PHBV18/AgNPs over compression molded PHBV3. The implementation of both strategies resulted in active nanocomposites with strong antimicrobial activity against food-borne pathogens, being the electrospinning coating technique the most efficient one in reducing the bacterial and virus population, even at very low AgNPs loading (from 0.002 to 0.04% wt.). As an alternative route, an integrated bioprocess for the biological synthesis of AgNPs and polyhydroxybutyrate (PHB) from the fermentation process with Cupriavidus necator was also carried out. Interestingly, this work demonstrated for the first time, the inherent capacity of C. necator to reduce silver nitrate and produce AgNPs without the need for adding a reducing agent. The process was successfully optimized and scaled-up to a fully automated 10 liters bioreactor. Finally, because of the limitations of the use of AgNPs in food applications, antimicrobial PHAs films based on zinc oxide (ZnO) and copper oxide (CuO) nanoparticles were prepared according to the previously developed strategies but in this case, a melt-mixing process of preincorporated ZnO into unpurified PHBV18 fiber mats made by electrospinning was also carried out to stabilize the metal nanoparticles. The effect of ZnO nanoparticles morphology and the method of ZnO/CuO incorporation on the morphological, optical, thermal, mechanical and barrier properties of the resulting active films as well as their influence on the antimicrobial (bactericide and virucidal) performance were studied. Thus, this PhD thesis represents a significant step forward in the understanding of the antimicrobial efficacy of highly dispersed and distributed nanometals and highlights the suitability of the developed PHAs/nanometals materials for antimicrobial applications and in particular for antimicrobial active food packaging applications.

El desarrollo de nuevos biomateriales con propiedades antimicrobianas para aplicaciones de envasado activo resulta un tema de gran interés en la actualidad. La presente tesis doctoral estudia el desarrollo por vía biotecnológica de polihidroxialcanoatos (PHAs) conteniendo nanometales para aplicaciones de envasado activo antimicrobiano de alimentos. En primer lugar, se produjeron nanopartículas de plata (AgNPs) por reducción química y se estabilizaron in situ en una suspensión de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) no purificado, PHBV18 (18% en moles de valerato), obtenido previamente a partir de cultivos mixtos microbianos. Posteriormente, las AgNPs estabilizadas se utilizaron para desarrollar nanocompuestos de PHAs-AgNPs siguiendo dos estrategias diferentes: 1) un proceso de mezclado-fundido en donde las AgNPs se añadieron al PHBV3 (3% mol de valerato) a partir de un masterbatch de nanopartículas altamente dispersas y distribuidas y, 2) como una estructura bicapa formada por un recubrimiento a base de PHBV/PHBV18/AgNPs depositado sobre un film de PHBV3 obtenido por moldeo por compresión. La aplicación de ambas estrategias dio lugar a nanocompuestos activos con una fuerte actividad antimicrobiana frente a patógenos transmitidos por los alimentos, siendo la estructura bicapa la más eficaz en la reducción de la población bacteriana y viral, incluso a una carga muy baja de AgNPs (de 0.002 a 0.04% en peso). Como ruta alternativa, también se llevó a cabo un proceso integrado de fermentación con Cupriavidus necator para la síntesis biológica de AgNPs y polihidroxibutirato (PHB). En este trabajo se demostró, por primera vez, la capacidad inherente de C. necator para reducir nitrato de plata y producir AgNPs sin la necesidad de añadir un agente reductor. El proceso fue optimizado y escalado satisfactoriamente a un biorreactor automatizado de 10 litros. Finalmente, debido a las limitaciones del uso de AgNPs en aplicaciones alimentarias, se prepararon films antimicrobianos de PHAs basados en nanopartículas de óxido de zinc (ZnO) y óxido de cobre (CuO) de acuerdo con las estrategias previamente desarrolladas. Adicionalmente, ambas estrategias se compararon con una tercera basada en la preincorporación de ZnO en fibras de PHBV18 no purificado y su posterior mezclado-fundido con polímero virgen. Se estudió el efecto de la morfología de las nanopartículas de ZnO y del método de incorporación de ZnO/CuO sobre las propiedades morfológicas, ópticas, térmicas, mecánicas y de barrera de los films activos resultantes, así como su influencia en el comportamiento antimicrobiano (bactericida y virucida). Por lo tanto, esta tesis doctoral representa un avance significativo en la comprensión de la eficacia antimicrobiana de nanometales altamente dispersos y distribuidos y destaca la idoneidad de los materiales desarrollados a base de PHAs y nanometales para aplicaciones antimicrobianas y, en particular, para aplicaciones de envasado de alimentos activos antimicrobianos.

El desenvolupament de nous materials d'origen biològic amb propietats antimicrobianes per a aplicacions d'envasament actiu és un tema d'interès significatiu. La tesi doctoral actual s'ocupa del desenvolupament de polihidroxialcanoats (PHA) reforçats amb nanometals per via biotecnològicament per a aplicacions d'envasat actiu antimicrobià d'aliments. Inicialment, les nanopartícules de plata (AgNPs) van ser produïdes per reducció química i estabilitzades in situ dins en suspensions de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) sense purificar, PHBV18 (18 mol% de valerat), prèviament obtinguts a partir de cultius mixtes microbians. Las AgNPs estabilitzades es van usar posteriorment per a desenvolupar nanocompostos de PHA's- AgNPs seguint dues estratègies diferents: 1) Procés directe de barreja en fusió que no utilitza dissolvents orgànics o estabilitzants addicionals i on es van afegir les AgNPs al PHBV3 (3% mol valerato) a partir d¿un masterbath on estaven perfectament disperses i distribuïdes 2) com una estructura bicapa formada per un recobriment de PHBV3 / PHBV18/AgNPS que es deposita sobre un film de PHBV3 obtingut per modelat per compressió. L'aplicació d'ambdues estratègies va donar lloc a nanocompostos actius amb una forta activitat antibacteriana enfront de patògens transmesos pels aliments, sent l'estructura de doble capa la més eficaç en la reducció de la població bacteriana i viral, fins i tot a una càrrega molt baixa de AgNPs (de 0.002-0.04% en pes). Com ruta alternativa, també es va dur a terme un procés integrat de fermentació amb Cupriavidus necator per a la síntesi biològica de AgNPs i polihidroxibutirato (PHB). En aquest treball es demostra, per primera vegada, la capacitat inherent de C. necator per reduir la sal de plata i produir AgNPs sense la necessitat d'afegir un agent reductor. El procés va ser optimitzat i escalat satisfactòriament a un bioreactor de 10 litres. Finalment, a causa de les limitacions de l'ús de nanopartícules de plata en aplicacions alimentàries, es van preparar films antimicrobians de PHA que incorporessin nanopartícules d'òxid de zinc (ZnO) i òxid de coure (CuO) d'acord amb les estratègies prèviament desenvolupades. Les dues estratègies es van comparar amb una tercera basada en la preincorporació de ZnO en fibres de PHBV18 no purificat i aquestes fibres es van barrejar posteriorment amb polímer verge. Es va estudiar l'efecte de la morfologia de les nanopartícules de ZnO i el mètode de la incorporació de ZnO/CuO sobre les propietats morfològiques, òptiques, tèrmiques, mecàniques i de barrera dels films actius resultants, així com la seva influència en el comportament antimicrobià (bactericida i virucida). Per tant, aquesta tesi doctoral representa un pas endavant significatiu en la comprensió de l'eficàcia antimicrobiana de nanometales altament dispersos i distribuïts i posa en relleu la idoneïtat dels materials desenvolupats basats en PHAs i nanometals per a aplicacions antimicrobianes i, en particular, per a aplicacions d'envasat d'aliments actius antimicrobians.