El papel clave de la modificación post-traduccional SUMO entre el Factor Inducible por Hipoxia-1α y la vía de señalización Notch en Células Madre Mesenquimales

Abstract

Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have been widely studied in recent years as regenerative cell therapy in various pathologies, including cardiovascular diseases such as myocardial infarction. For some years now, cells (including MSCs) have been known to overexpress Hypoxia Inducible Factor (HIF) under hypoxia conditions (low oxygen levels). The research group led by Dr. Pilar Sepúlveda showed that the exogenously overexpression of HIF-1α in MSCs (lentiviral transduction) could simulate some of the mechanisms triggered by hypoxia, thus increasing the therapeutic potential of MSCs, but avoiding the possible adverse effects of keeping cells at low oxygen concentrations. HIF-1α is a transcription factor that regulates the adaptive response to hypoxia, which interacts with a large number of proteins that are responsible for increasing or decreasing its function. Among these proteins HIF-1α has been shown to interact with Notch signalling pathway. Notch receptors and their ligands are transmembrane proteins that regulate the acquisition of a commitment to a certain cell type, differentiation, proliferation, maintenance of stem cell characteristics and apoptosis. When the Notch receptor binds to its ligand, there are a number of events that end with release of the intracellular domain of Notch (NICD) by action of the γ-secretase enzyme. NICD can be translocated to the nucleus, where it stimulates the transcription of gene families like Hes and Hey. Under hypoxia conditions, activation of Notch signalling pathway is essential to determining angiogenic process. On the other hand, a fine balance between levels of SUMOylation / deSUMOylation has been seen necessary for the correct activation of the hypoxia signalling cascade. SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) is a family of small proteins (11KDa) that covalently bind to the lysine residues of other target proteins post-translationally. SUMOylation is involved in various biological processes such as nuclear translocation, DNA repair, signal transduction and transcriptional regulation. Recently, a relationship between these three elements has been established: HIF1-α, Notch pathway and SUMO modifications. No group has so far shown that this modification occurs directly on the intracellular Notch domain, with a greater SUMOylation when the cells are in hypoxia situation. Through immunoprecipitation studies, we have been able to detect the direct SUMOylation of the Notch1 Intracellular Domain (N1ICD), where SUMOylation levels are higher when cells overexpress HIF-1α. By cell fractionation assays we have been able to check that the fact that N1ICD is SUMOylated causes a greater translocation to the interior of the nucleus, thus increasing the transcription of Notch downstream genes (e.g. Hes1, Hey1 and Hey2). The SUMOylation of N1ICD has also been observed in HEK-293T cell line stabilized the expression of HIF-1α by hypoxia conditions. In addition, in order to corroborate this association, directed mutagenesis assays to three specific sequences capable of being SUMOylated within Notch1 intracellular domain have been carried out. Our aim is to check the main binding site of the SUMO protein to Notch1 intracellular domain, and to establish a direct relation between sequence, post-translational modification, and nuclear translocation of the transcriptional factor. With this work we have tried to study how the post-translational modification (SUMO) of the activated form of Notch1 receptor generates a cross-coupling between Notch and HIF-1α signalling pathways. These findings provide important evidence of the role of N1ICD SUMOylation in the biology of mesenchymal cells, suggesting the possible stabilization of this modification as a novel strategy in cell therapy.

Las Células Madre Mesenquimales (MSC) han sido ampliamente estudiadas en los últimos años como terapia celular regenerativa en diversas patologías, entre las que se encuentran las enfermedades cardiovasculares como el infarto de miocardio. Desde hace unos años, se sabe que las células, incluidas las MSC, en condiciones de hipoxia (niveles bajos de oxígeno) sobreexpresan el Factor Inducible por Hipoxia (HIF). El grupo de investigación liderado por la Dra. Pilar Sepúlveda demostró que la sobreexpresión de HIF-1α en MSC de manera exógena (transducción lentiviral), podía simular algunos de los mecanismos desencadenados por la hipoxia, aumentando así el potencial terapéutico de las MSC, pero evitando los posibles efectos adversos de mantener a las células a bajas concentraciones de oxígeno. HIF-1α es un factor de transcripción que regula la respuesta adaptativa a la hipoxia, el cual interacciona con un gran número de proteínas que se encargan de aumentar o disminuir su función. Entre estas proteínas se ha visto que HIF-1α interacciona con la vía Notch. Los receptores Notch y sus ligandos son proteínas transmembrana que regulan la adquisición de un compromiso hacia cierto tipo celular, diferenciación, proliferación, mantenimiento de las características de células madre y apoptosis. Cuando el receptor Notch se une a su ligando, se dan una serie de eventos que finalizan con liberación por parte de la enzima γ-secretasa del dominio intracelular de Notch (NICD) el cual puede translocarse al núcleo, donde estimula la transcripción de familias de genes como Hes y Hey. Bajo condiciones de hipoxia, la activación de la vía Notch es clave para el proceso angiogénico. Por otra parte, se ha visto un fino equilibrio entre los niveles de SUMOilación/deSUMOilación necesario para la correcta activación de la cascada de señalización de hipoxia. SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) es una familia de proteínas de pequeño tamaño (11KDa) que se unen covalentemente a los residuos de lisina de otras proteínas diana de manera post-traduccional. La SUMOilación está implicada en diversos procesos biológicos tales como translocación nuclear, reparación del ADN, transducción de señales y regulación transcripcional. Recientemente se ha establecido una relación entre estos tres elementos: HIF1-α, vía de Notch y modificaciones SUMO. Ningún grupo había demostrado hasta el momento que esta modificación se produce directamente sobre el dominio intracelular de Notch, siendo mayor cuando las células se encuentran en hipoxia. Gracias a estudios de inmunoprecipitación, hemos sido capaces de detectar la SUMOilación directa del Dominio Intracelular de Notch1 (N1ICD) donde los niveles de SUMOylación son mayores cuando las células sobreexprean HIF-1α. Mediante ensayos de fraccionamiento celular hemos podido comprobar que el hecho de que N1ICD esté SUMOilado hace que se produzca una mayor translocación al interior del núcleo, aumentando así la transcripción de los genes aguas debajo de Notch (p.ej. Hes1, Hey1 y Hey2). La SUMOilación de N1ICD también se ha observado en la línea celular HEK-293T estabilizado la expresión de HIF-1α mediante condiciones de hipoxia. Además, con el fin de corroborar esta asociación, se han llevado a cabo ensayos de mutagénesis dirigida hacia tres secuencias concretas susceptibles de ser SUMOiladas dentro del dominio intracelular de Notch1. Nuestro objetivo es comprobar el principal sitio de unión de la proteína SUMO al dominio intracelular de Notch1, pudiendo establecer una relación directa entre secuencia, modificación post-traduccional y translocación nuclear del factor transcripcional. Con este trabajo se ha pretendido estudiar cómo la modificación post-traduccional (SUMO) de la forma activada del receptor Notch1 genera un acoplamiento cruzado entre las vías de señalización Notch y HIF-1α. Estos hallaz