Función y origen de los plásmidos en especies de Erwinia patógenas y epífitas de frutales de pepita

Abstract

Fire blight is considered the most serious disease affecting pome fruit and ornamental and wild rosaceae. The causal agent is the bacterium Erwinia amylovora, considered a quarantine organism in the EU. This species has been extensively studied, but at the genomic level there is still much to know, as there are currently only two genomes published and another thirteen were assembled in scaffolds. Its pangenoma is considered open, although with a core with a high sequence identity. There is very little intraspecific variability, which is manifested in a low genotypic diversity, being noticed that the plasmids are the major source of genetic variability. This could explain the differences in virulence in strains, as well as their better adaptation to the different environmental conditions. The plasmid pEA29 described in the majority of the strains of E. amylovora, and with a quantitative effect in virulence, was not found in some Spanish isolates of the bacterium. The study of these strains gave way to the discovery of another plasmid, pEI70, which is present in strains of several European countries. After pEA29, pEI70 is the one with the highest presence. The function, distribution and genetic content of this plasmid, as well as the effect of pEA29 and pEI70 on the expression of the chromosomal genes in strain bearing them, have been studied. The inoculation experiments on fruit with the strains to which the plasmid pEI70 or pEA29 had been introduced compared to that same strain without plasmids showed an increase in virulence, which was manifested in a reduction in the time of the emergence of symptoms and in which they appeared more aggressively. An experiment was carried out using a microarray, in order to study if the presence of each one of these plasmids could affect the expression on certain chromosomal genes that would explain that variation in virulence of the carrier strain, using a microarray. The results demonstrated the role of both plasmids to affect gene expression, between 120 and 180 chromosomal genes according to the plasmid carrying the strain, in each case enriching different functional categories, although 28 of them were coincident in the two cases. E. piriflorinigrans is a newly described pathogenic species that produces necrosis only in pear blossoms but does not appear to affect other organs. Both species share phenotypic and molecular characteristics, making their distinction difficult. Its detection and correct identification was a challenge because the symptoms it causes are practically indistinguishable from those caused by E. amylovora. In this work new plasmid pEPIR37 found in this new species was studied also. This is present in all analyzed strains. When this plasmid was introduced into strains of the species E. amylovora cured of plasmids, they showed an increase in virulence comparable to that observed with pEA29, suggesting that pEPIR37 produces a similar effect. Two specific and sensitive real-time and conventional PCR protocols have also been developed to identify, detect and differentiate E. piriflorinigrans from E. amylovora and other species of this genus using primers designed from specific sequences, annoted in this same work, from plasmid pEPIR37. This has allowed to identify this new species in other hosts as Pyracantha sp., besides pear tree and in other regions where previously it had not been detected. Likewise, these results have allowed to know biological and epidemiological aspects of E. piriflorinigrans that contribute to have new key scientific information to establish strategies for its control in pome fruit trees. The study of the plasmids and their functions in these two phylogenetically related species and their role in the adaptation to the environment in which these species live, as well as in the virulence of the strains that carry them, could give new clues about the origin of both pathogens, their evolution, their biological cycle and interaction with the host plant

El fuego bacteriano está considerada la enfermedad más grave que afecta a frutales de pepita y rosáceas ornamentales y silvestres. El agente causal es la bacteria Erwinia amylovora, perteneciente a la familia Erwiniaceae, organismo de cuarentena en la UE. Esta especie ha sido ampliamente estudiada, pero a nivel genómico todavía queda mucho por conocer, ya que en la actualidad existen únicamente dos genomas completamente secuenciados y anotados, y otros trece en scaffolds, de cepas de E. amylovora de diferentes orígenes geográficos y huéspedes. Su pangenoma se considera abierto, aunque con un core con una alta identidad de secuencia en estas cepas. Existe muy poca variabilidad intraespecífica, lo que se manifiesta en una escasa diversidad genotípica, advirtiéndose que los plásmidos son la mayor fuente de variabilidad genética que podría explicar las diferencias en virulencia en cepas portadoras de plásmidos, así como su mejor adaptación a diferentes condiciones ambientales. El plásmido pEA29 descrito en la mayoría de las cepas de E. amylovora, y con un efecto cuantitativo en virulencia. El estudio de estas cepas sin plásmido dio paso al descubrimiento de otro plásmido que se ha denominado pEI70, presente en cepas de varios países europeos. Se ha estudiado su función, distribución y contenido genético, así como el efecto del pEA29 y del pEI70 sobre la expresión de los genes cromosómicos de la cepa que los porta, tras la infección en fruto inmaduro. Los experimentos de inoculación con las cepas a las que se les había introducido el plásmido pEI70 o el pEA29, en comparación con esa misma cepa sin plásmidos, mostraron un aumento de la virulencia. Por todo ello, con el fin de estudiar si la presencia de cada uno de estos dos plásmidos podría producir efectos sobre determinados genes cromosómicos que explicarían esa variación en virulencia, se realizó un experimento de expresión génica diferencial usando un microarray. Los resultados demostraron el papel de ambos plásmidos al afectar a la expresión de entre 120 y 180 genes cromosómicos según el plásmido que porte la cepa, enriqueciéndose en cada caso categorías funcionales diferentes. Por otro lado, E. piriflorinigrans es una especie patógena descrita recientemente que produce necrosis sólo en las flores de peral, pero no parece afectar a otros órganos. Además, ambas especies comparten características fenotípicas y moleculares. Su detección y correcta identificación era un reto debido a que los síntomas que provoca en flores son prácticamente indistinguibles a los causados por E. amylovora. Se ha estudiado el contenido genético de un plásmido de 37 Kb, pEPIR37 presente en todas las cepas analizadas de la especie. Además, se ha observado que cuando este plásmido es introducido en cepas de la especie E. amylovora curadas de plásmidos, mostraron un nivel de virulencia mayor, comparable a la observada en las cepas portadoras del plásmido pEA29, lo que parece indicar que este plásmido produce un efecto similar. En este trabajo también se han desarrollado dos protocolos específicos y sensibles de PCR en tiempo real y convencional para identificar, detectar y diferenciar E. piriflorinigrans de E. amylovora y de otras especies de este género, usando secuencias específicas del plásmido pEPIR37. Ello ha permitido identificar esta nueva especie en otros huéspedes como en otras regiones en donde no se había detectado. Asimismo, estos resultados han permitido conocer aspectos biológicos y epidemiológicos de E. piriflorinigrans que aportan nueva información científica que resultaría para establecer estrategias para su control. El estudio de los plásmidos y sus funciones en estas dos especies tan relacionadas filogenéticamente y su papel en la adaptación al medio en el que ambas habitan, así como en la virulencia de las cepas que los portan, podría dar nuevas pistas sobre el origen de estos patógenos, su evolución

El foc bacterià està considerada la malaltia més greu que afecta arbres fruiters de pinyol i rosàcies ornamentals i silvestres. L'agent causal d'aquesta malaltia és el bacteri Erwinia amylovora, organisme de quarantena a la UE. Aquesta espècie ha estat àmpliament estudiada, però a nivell genòmic encara queda molt per conèixer, ja que en l'actualitat únicament existeixen dos genomes publicats, i altres tretze assemblades scaffolds. El seu pangenoma es considera obert, tot i que aquests soques posseeixen un core amb una alta identitat de seqüència. Hi ha molt poca variabilitat intraespecífica, el que es manifesta en una escassa diversitat genotípica, advertint-se que els plasmidis són la major font de variabilitat genètica que podria explicar les diferències en virulència a les soques, així com la seua millor adaptació a les condicions ambientals. El plasmidi pEA29 descrit en la majoria de les soques d'E. amylovora, i amb un efecte quantitatiu en virulència, no es va trobar en alguns aïllats espanyols del bacteri, donant pas al descobriment d'un altre plasmidi, pEI70. Per això, després del pEA29, el plasmidi pEI70 és el de major. S'ha estudiat la funció, distribució i contingut genètic d'aquest plasmidi, així com l'efecte del pEA29 i del pEI70 sobre l'expressió dels gens cromosòmics. Els experiments d'inoculació en fruit amb les soques amb els plasmidis van mostrar un augment de la virulència, que es manifestava en una reducció en el temps de l'aparició de símptomes i en què aquests es presentaven de forma més agressiva. Per tal d'estudiar si la presència de cada plasmidi podria produir efectes sobre determinats gens cromosòmics que explicarien aquesta variació en virulència de la soca portadora, es va realitzar un experiment d'expressió genètica diferencial mitjançant un microarray. Els resultats obtinguts van demostrar el paper dels dos plasmidis en afectar l'expressió d'entre 120 i 180 gens cromosòmics segons el plasmidi que porta la soca, enriquint-se en cada cas categories funcinals diferents, tot i que 28 d'ells van ser coincidents en els dos casos. E. piriflorinigrans és una espècie patògena descrita recentment que produeix necrosi només en les flors de perera. Les dues espècies comparteixen característiques fenotípiques i moleculars, fent difícil la seua distinció. La seua detecció i correcta identificació era un repte. En aquest treball també s'ha avaluat el contingut genètic d'un plasmidi de 37 Kb, anomenat pEPIR37, present en totes les soques analitzades de l'espècie E. piriflorinigrans, i a més s'ha observat que quan aquest plasmidi era introduït en soques de l'espècie E. amylovora curades de plasmidis, que per això tenen una virulència reduïda, van mostrar una virulència major, comparable amb l'observada en les soques portadores del plasmidi pEA29, el que indicaria que aquest plasmidi produeix un efecte similar.Per tot això en aquest treball també s'han desenvolupat dos protocols específics i sensibles de PCR en temps real i convencional per identificar, detectar i diferenciar E. piriflorinigrans d'E. amylovora i d'altres espècies d'aquest gènere, usant iniciadors dissenyats a partir de seqüències específiques, anotades en aquest mateix treball, del plasmidi pEPIR37. Això ha permès identificar aquesta nova espècie a altres hostes com Pyracantha sp., a més de perera i en altres regions on anteriorment no s'havia detectat. Així mateix, aquests resultats han permès conèixer aspectes biològics i epidemiològics d'E. piriflorinigrans que aporten nova informació científica clau per establir estratègies per al seu control en arbres fruiters de pinyol. L'estudi dels plasmidis i les seues funcions en aquestes dues espècies tan relacionades filogenèticament i el seu paper en l'adaptació al medi on habiten, així com en la virulència de les soques que els porten, podria donar noves pistes sobre l'origen dels dos patògens, la seua evolu